[自然科学]SSH Technology Overview.pptVIP

Real time qPCR confirmed data Thank you! * * 上海欧孚生物医药科技有限公司 唐 荣 tech@ SSH简介 抑制性消减杂交（Suppression subtraction hybridization，SSH）是根据抑制PCR原理建立起来的寻找差异表达基因的方法。 1996年，Diatchenko首次报道。 优点 ：相对于DDRT-PCR、cDNA－RDA及SAGE等方法 低丰度mRNA富集效率高 假阳性低 灵敏度高 重复性 缺点： SSH得到的不是全长cDNA，需通过其他方法解决全长基因 和基因芯片一样，基于序列杂交原理，有一定的假阳性 SSH的应用 转录组学分析 发育和分化 组织差异（病理和正常样本） 植物抗药性差异 疾病易感性差异 微生物分型差异 基因组学分析 片段缺失分析 重组分析 样品采集 RNA提纯 cDNA合成 Rsa I酶切 消减杂交 Adaptor 连接 1st 消减PCR 2nd 消减PCR 克隆培养 宿主转化 载体连接 产物纯化 Q.C. Q.C. Q.C. SSH文库技术流程 组织样品的采集 Note：样品的处理是实验成功与否的一个关键环节，涉及基因表达特异性、杂序列污染等 细胞模型样品：离心后液氮速冻，转－80度保存，或离心后直接加入Trizol，振荡或匀浆破细胞。 血液组织样品：先用淋巴分离液进行分血，离心收集细胞，后续按细胞样品处理。 动植物模型样品：取材后液氮速冻，转－80度保存，同时需要做好比较详细的样本信息登记。 RNase Free 实验室 RNA酶广泛存在且难以灭活，是导致RNA降解的主要原因； 实验室应专门辟出RNA操作区，移液器、离心机、试剂等应专用； 操作区应保持清洁，并定期除菌； 操作过程中应始终戴一次性手套口罩，并经常更换； 实验涉及的试剂、耗材必须是RNase free ； RNA质量标准 A260 介于紫外分光光度计线性范围（0.1～1.0）之间 Ratio(A260/A280)介于1.8～2.0 之间 真核生物28S/18S 条带量比例范围：1～2 原核生物23S/16S 条带量比例范围：1～2 5S 条带亮度不能超过上述2 条主带 没有基因组DNA 污染 RNA的质量控制 1.紫外分光光度分析 A230、A260、A280、A320、Ratio(A260/280) 2.凝胶电泳分析 Agilent 2100 Analyzer（Lab on Chip） 琼脂糖凝胶电泳 3.RNA质量分析实验（2个验证实验） 部分物种RNA凝胶电泳图谱 28S:18S2.0 Total RNA的质量分析 28S 18S RNA的溶解和保存 根据沉淀量多少，加入适量RNase Free Water，室温放置2分钟溶解RNA。 RNA的短期保存：水溶液 -20 ℃保存。 RNA的长期保存：加入2倍体积的EtOH，混匀保存或将RNA沉淀下来，加入EtOH保存。 建库级RNA RNA类别 起始量 所需总RNA 特殊技术 Total RNA 50-2000ng / SMART扩增 mRNA 2ug ≥200ug / Sense RNA 2ug ≥2ug SMART扩增 Clontech SMART Amplification 技术理论： SMART 技术原理 LD PCR线性放大原理 技术应用 SSH 技术 SMART cDNA 文库 cDNA表达谱芯片杂交 SMART 技术原理 LD PCR线性放大原理 LD PCR线性扩增曲线 SMART cDNA Amp. Result SSH第一轮杂交原理 SSH第二轮杂交原理 SSH消减杂交PCR原理 对虾SSH双向文库构建案例 总RNA电泳图 T D Tester Driver T实验组 D对照组 D对照组 T实验组 Rsa I酶切电泳图 T D T D Adaptor PCR Test 消减PCR效率检测 消减纯化产物电泳 T D T:在T组中特异性表达基因，在D组中低表达或不表达 D:在D组中特异性表达基因，在T组中低表达或不表达 T 生物信息学分析 克隆测序 Blast分析 GO分类 Pathway分析 Data Validation Real time qPCR Reverse Transcription PCR Northern Blot Western Blot Dot Blotting 反向消减所得探针-P32 正向消减所得探针-P32 正向消减文库 反向消减文库 正向消减探针 反向消减探针 斑点杂交原理 Dot Blotting 用途： (1) 没测序之前，