[自然科学]第五章 基因工程的酶学基础_.pptVIP

用于核酸操作的工具酶 6. TagDNA聚合酶 热稳定聚合酶 最适反应温度72℃,但能忍受96 ℃。 分子标记常用，有强的5’?3’DNA聚合酶活性，缺3’ ? 5’活性，能扩增长达数千bp的DNA片段。 5. 几种常用限制酶识别位点 大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。 4. 限制酶酶切反应的终止 从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。 第二节 DNA 连接酶 一、DNA连接酶（ligase)的发现 1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化两条DNA的末端之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 DNA连接酶 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ OH P OH P 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ nick nick 二、DNA连接酶的基本性质与特点 DNA连接酶的基本性质 DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 T4-DNA连接酶 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ OH P nick 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 连接多个平头双链DNA分子： 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ 5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’ T4-DNA连接酶 （1）大肠杆菌连接酶 1. 两种DNA连接酶 只能连接粘性末端。 DNA ligase的特点 （2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。 （1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA 3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ 2. 连接条件 DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1 mM DTT 5 mM Volume 10 - 20 ml T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时， 完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量 三、连接反应的条件 第三节 DNA聚合酶 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T4 DNA聚合酶 4. T7 DNA聚合酶 5.逆转录酶 6. Tag酶 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’-OH端。 2. 主要区别 T7 DNA聚合酶、Tag酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 二、常用的DNA聚合酶的特点 持续合成能力和外切酶活性不同。 高 快 有 无 Taq DNA聚合酶 中 低 无 无 逆转录酶 高 快 无 无 遗传修饰T7DNA聚合酶 高 快 无 低 化学修饰T7DNA聚合酶 高 快 无 高 T7DNA聚合酶 低 中 无 高 T4DNA聚合酶 低 中 无 低 Klenow fragment 低 中 有 低 大肠杆菌DNA聚合酶 持续能力 聚合速率 5’?3’外切酶活性 3’?5’外切酶活性 DNA聚合酶 3. 常用DNA聚合酶的特性比较 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸修饰酶 第五章 基因工程的酶学基础 限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》统计，仅II型限制性核酸内切酶就已从各种不同的微生物中分离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。 第一节 限制性核酸内切酶 一、基本概念及其生物功能 19