免疫组织化学技术进展及应用概要.pptVIP

免疫组织化学技术进展及应用 山西医科大学第二医院病理科 张晓琴 一、免疫组织化学技术的概念 免疫组织化学技术是利用抗原与抗体的特异性结合，并利用酶作用于底物，发生一系列化学反应显色，借助显微镜观察着色部位，从而鉴定组织或细胞结构的化学成分和化学性质的技术。 抗原：是一类在合适条件下，能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答所产生的效应物质（包括抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。其两种性能a免疫源性b反应源性 抗原决定簇：又称抗原表位，决定抗原的特异性，是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化学基团。 抗体：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B淋巴细胞活化、增殖、分化成为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白（凝集素、调理素、沉淀素）。 抗体大部分位于r区带。r球蛋白并非都有抗原活性。免疫球蛋白是包括了抗体和化学结构与抗体相同或相似，但却无抗体活性的异常球蛋白 抗原抗体的结合具有高度的特异性，是物理化学吸附现象，抗原抗体复合物在一定的条件下可以解离。 二、免疫组织化学技术的起源和发展 1966年NaKane建立了免疫酶标记技术，之后这门技术发展迅速，从直接酶标法发展到间接酶标法，在这期间，由于所用标记物的不同或标记方法的不同，由此衍化出的方法多达二十种以上。 用以做标记的物质：生物素、地高辛、胶体金，荧光素、酶、同位素等。其中用于标记的酶有辣根酶、碱磷酶、葡萄糖氧化酶等等。 根据酶标记的对象的不同： 直接酶标法：将酶直接标记在特异性的抗体上。 间接酶标法：将酶标记在特异性抗体之外的其他参与反应的物质上。 根据酶在反应过程中扮演的角色不同： 酶标抗体法 抗原—抗体—酶标二抗—显色 非标记抗体酶法 抗原—抗体—抗酶抗体—酶—显色 如：PAP法、APAAP法 那么，现在又根据免疫组化方法中是否有生物素的参与，我们又把免疫组化试剂分为生物素检测系统和非生物素检测系统 其实，现在的多数的免疫组化方法，是多种技术的有机的融合，它吸取了各种免疫组化理论基础的优点，使免疫组化技术更趋向于成熟和稳定，更方便于广泛的运用。 作为一个高水平的技术员，而不仅仅是一个操作工，应该认真学习弄通免疫组化技术的理论和原理，才能在实际工作中从容应对随时出现的问题，做到以不变应万变。 到目前为止，最广泛的用于病理组织学诊断和临床科研的免疫组化方法是我们今天重点介绍的SP法和Elivision法,这两种方法所用的标记酶均为过氧化物酶（Peroxidase） 三、最常用的免疫组化染色法 1：SP法 2：Elivision法 1：SP法 主要是利用了生物素（biotin）与链霉菌抗生物素蛋白（S-avidin）之间具有的高度的亲合力。 生物素和抗生物素蛋白是自然界中具有最强结合力的物质之一，并且它们同时和抗体或酶交联，并不影响它们的生物学活性。而SP法正是利用了他们的这一特性，同时，每个S-avidin分子具有的四个亚单位，这种特殊的结构使的抗原抗体结合的信号可以有效的呈多级放大，便于我们的镜下观察，有利于我们作出阳性的判断。这就是我们常说的三步法。 主要操作步骤如下： 在组织切片或细胞片上加入特异性的一抗 其次，加入生物素标记的二抗 随后，加入与过氧化物酶交联的链抗生物素蛋白（即所谓的三抗）。 最后DAB显色 SP法反应原理示意图 2：Elivision法 是应用了多聚物技术的最新一代免疫组化非生物素检测系统，它利用高分子葡聚糖或有机单位小分子直接将二抗的免疫球蛋白与过氧化物酶联结成多聚体形式。使每一个抗体分子与多个酶分子相连，直接放大了抗原抗体结合的信号，替代了传统SP法中的二抗三抗。这就是所谓的二步法。 主要操作步骤如下： a）在组织切片或细胞片上加入特异性的一抗 b）第二步，加入二抗过氧化物酶多聚体。DAB显色。 Elivision法反应原理示意图 四、SP三步法与Elivision二步法的比较 SP三步法的产生和建立远早于Elivision二步法，是经过多年的实践并得到不断完善的染色方法，它灵敏度高，特异性强，价格相对低廉，用于病理诊断及科研多年，在各级规模医院中被广泛应用，得到了普遍的认可。正是由于这种方法的建立，发展和壮大了免疫组化技术在医学领域中的运用范围。使免疫组化技术得以广泛的普及。 但不可避免的是它也存在着很多的缺点，比如：操作步骤较烦琐，实验时间长；另一方面，由于它运用了生物素-链抗生物素蛋白系统，而人体组织中，特别是肝、肾脑等组织中都有较高的内源性生物素，加上实验过程中所必需的抗原修复也可导致内源性生物素的激活，最终使得非特异性的背景着