微卫星手册(个人整理).doc

该手册尚属于编写阶段，如有错误请告知作者，以便尽快更正 SSR操作手册 第一部分：DNA制备 一、DNA抽提（酚氯仿抽提） 1 研 磨：分别取0.05g组织，加入液氮研磨粉碎，将粉末转至1.5mL的离心管中。加入500ul 裂解液。0.5ulRNA酶，20ul20mg/ml蛋白酶K。55℃水浴消化至完全溶解。 2 加入等体积饱和酚（Phenol astuorated）轻轻混匀（混匀半小时）于4℃以12,000rpm离心20min. 3小心移取上清液于新的灭菌管后加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混匀（混匀不能太剧烈，以保证DNA完整性），于4℃以12,000rpm离心15min。 4 小心移取上清液于新的灭菌管后加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）上下颠倒混匀，于4℃以12,000rpm离心15min。 5沉淀DNA： 小心移取上清液于新的灭菌管，加1/10体积（50ul）的3M的NaAC和2倍体积（1000u L） 预冷的无水乙醇（-20℃）于-20℃冰箱沉淀过夜沉淀DNA。 6于4℃以10,000rpm离心15min，弃上清（小心不要吸走沉淀）。 7 将沉淀于室温放置放置，至无酒精味（不要过分干燥）。 8溶解：加入适量的TE溶解（50uL—200ul），置于4℃冰箱1-2h，使DNA充分溶解。 9 保存：将DNA样于-20℃冰箱保存备用。 （梁利群）：裂解液采用改进的配方(成份：10 mmol／L EDTA，200u g／mL Proteinase K．0．5％ Sarcosyl)，取0．5 g尾鳍剪碎，加入500 ul裂解液，50℃消化12 h，94℃ 消化4 min，加等体积酚饱和溶液于机械手上缓慢转动抽提2 h，5 000 g离心5 min，吸上清，用酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)抽提2次，最后用氯仿：异戊醇(体积比24：1)抽提1次，将上清加入2倍体积的无水乙醇沉淀，15000 g离心20 min，再用70％ 乙醇洗涤2次，离心干燥机抽干，加入适量的1／10TE(10 mmol／LTris—HCl，pH8．0； 1 mmol／LEDTA，pH8．0)缓冲液溶解，4℃保存备用． 注意： 1 蛋白酶K和RNA酶保存于-40℃冰箱中。使用时取出后置冰上融化，裂解液室温保存，若有沉淀则加热（水浴或微波）溶解后使用。 2 加氯仿：异戊醇作用为去蛋白，可再重复一次，但会损失DNA。 3 苯酚是蛋白质的变形剂，氯仿有利于分相，除去蔗糖及痕量酚，异戊醇可减少气泡，溶解RNA。让离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收，也可以用1倍体积的异戊醇沉淀DNA，室温下放置15-30min即可。 DNA降解原因： 1 从动物身上取下的组织没有立即处理或冰冻。 2 用于抽提的样品，或已经抽提的RNA样品存放于-5℃—-20℃,而没有存放于-60℃—-70℃。 3 使用了Polytron或其他高速的匀浆器匀浆样品。 每mg组织或1*106培养细胞预期的DNA产量： 肝和肾 3—4ug 骨骼肌、脑组织和胎盘 2—3ug 培养的人、小鼠、大鼠细胞 5—7ug 纤维母细胞 5—7ug 二、DNA质量检测和定量 DNA质量检测：使用琼脂糖凝胶检测 1 制胶：0.8%—1%琼脂糖凝胶。整块胶版需60ml琼脂糖凝胶，按比例加琼脂糖和0.5%TBE缓冲液于锥形瓶中（量多可盖上PE手套，并刺几个洞，防止溅出），微波炉加热3min，中间要混匀3—5次。直到琼脂糖充分溶解。静置待50℃或手可握瓶的温度将琼脂糖凝胶缓慢倒入模具（插好合适的梳子）中，冷却（有气泡需把气泡赶出）。（冷却至少半小时，且不可过长，如需急用，可放到4℃冰箱中冷却。） 2 电泳 3 染色 EB染色，置胶于EB（ethidium bromide）中10s，迅速置于超纯水5—10min。 4 拍照 注意：EB是强诱变剂且剧毒。操作需戴手套。用后需妥善处理。 三、DNA定量： 使用核酸蛋白检测仪，定量分析 1 比色皿用灭菌水冲洗三次 2 加99ul灭菌水，调零。 3 拿出比色皿，加1ul抽提DNA。用枪混匀，测OD值 记录：DNA含量 OD260/OD280 （1.6-1.8较好，1.6表明有蛋白污染，1.8表明有RNA污染） OD260/OD230 如果是RNA样品，则OD260/OD2802.0.若2.0则有蛋白质、酚类污染。 注意：1 拿比色皿要拿磨砂面 2 勤盖核酸蛋白仪盖子 3 每个样品都需要重新调零 四、DNA稀释 将储存DNA用TE稀释至10ng/ulDNA工作液。（不用一次配好。） 五、SSR-PCR 苗师兄PCR体系（15ul） H2O 9.15 ul 10*PCR buffer 1.5 ul dNTP 1.2 ul