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冷冻病理学 概 述 冷冻治疗的实质是利用低温冷冻方法破坏病变组织，最后达到去除病变的目的。冷冻所借助的手段就是通过反复的冻 — 融过程使病变组织坏死，这种坏死过程有别于一般坏死，其修复过程也有别于一般坏死后的修复过程，有其自身的特点；因此，了解冷冻后组织的病理变化特点有助于该治疗手段的合理应用。虽然不同组织冷冻后的病理变化各有特点，但基本改变是类似的，故本章将选取一些代表性的组织冷冻后的病理改变的机制、超微结构、光镜下的形态改变作概要说明。 第一节 冷冻致细胞损伤的机制和病理改变 一、冷冻损伤的机制 冷冻的作用主要就是使局部快速降温、冻结、复温，在此过程中产生一系列的病理变化，最终导致细胞受损而死亡。由细胞内、外液中因冻结而分离出的纯水形成冰晶，并由此而产生的一系列变化是冷冻致组织损伤的重要机制。冷冻治疗过程中还存在冷冻速度的区别，因此致细胞损伤的作用的机制可能也存在一些差别。目前关于冷冻致细胞死亡的机制主要存在以下几种学说：迅速的低温使细胞内外的水分形成冰晶，细胞脱水，细胞内电解质浓度增高，使脂蛋白复合体受到破坏，引起细胞膜的溶解损伤从而致细胞死亡；冷冻还可伤害线粒体中的光磷酸化作用，使三磷酸腺苷的合成发生不可逆性的裂解，造成细胞器膜的损害，而琥珀酸脱氢酶的活性有赖于线粒体膜的完整性，溶酶体膜的破坏可导致其中酶的释放，引起细胞的自溶，内质网、细胞核的膜均可在冷冻过程中发生破裂，而细胞可因细胞器的破坏而发生死亡；冷冻过程中由于细胞内外冰晶形成，可造成细胞内的脱水状态，体液浓缩，细胞内电解质浓缩，浓度达到有害的程度，同时酸碱度也随之改变，出现细胞酸中毒和代谢障碍，从而导致胞浆、胞膜、细胞内成分蛋白产生变形，进而导致细胞死亡；冷冻还可使细胞膜、蛋白等细胞成分中的结构水丢失，细胞因此失去功能而死亡；温度休克学说认为温度的急剧变化较绝对温度对细胞的杀伤作用更重要，这可能是由于细胞内组成成分缩胀比率不均衡以致细胞破裂的结果；组织冷冻后，血流速度减慢，这在小静脉表现的尤为明显，小静脉出现血流郁滞后，毛细血管的血流也就会出现障碍，继此之后，小动脉的血流也相应减少，最后同样发生郁滞，这种血流郁滞乃至造成微循环的阻断，另外，冷冻还可直接损伤毛细血管壁，使血小板和其他血细胞与损伤的血管壁黏附，在血管内形成血栓栓塞。毛细血管腔出现阻塞后，则血流停止，组织细胞出现缺血性梗死。 冷冻后继发的组织细胞坏死还可能与冷冻后所引起的一系列生化反应有关。 冷冻致细胞死亡的机制可能与细胞凋亡有关。凋亡是与坏死不同的另一种细胞死亡机制，它是一种耗能的主动的促细胞消亡的方式。冷冻治疗脑胶质瘤的动物模型表明在冷冻灶的中心以坏死为主，而在冷冻灶周围则出现较多的TUNEL阳性的细胞，这种细胞出现的峰值时间是24~48h，并可延缓到冷冻后的72h，与冷冻致组织中细胞坏死的时间分布相一致。上述研究表明凋亡可能是冷冻杀伤肿瘤细胞又一种机制。 有研究发现在冷冻致大鼠脑水肿的过程中，一氧化氮合酶（NOS）及一氧化氮（NO）在脑组织中浓度升高。其可能的原因是由于冷冻致脑组织中一氧化氮合酶的活性升高，进而导致一氧化氮的浓度升高；高浓度的NO损伤了毛细胞血管及紧密连接，血 — 脑脊液屏障功能破坏，发生血管源性脑水肿；同时，由于大量NO使多种酶的活性改变，能量耗竭，导致细胞毒性脑水肿的发生。NOS活性增加的可能原因是：兴奋性氨基酸增加，激活NMDA/谷氨酸受体，NOS活性增加；由于冻伤时组胺、白三烯C4、血小板激因子等大量化学介质释放，进而激活NOS。 通过冷冻后大鼠血清中丙二醛（一种脂质过氧化产物）的监测，发现血清中丙二醛的变化规律与冻后的临床过程相吻合，说明脂质过氧化过程在冷冻损伤、修复过程中具有重要作用。冷冻可以加强脂质过氧化过程，而脂质过氧化产生过多的自由基又可致组织损伤，进而产生更多的氧自由基。自由基又促进脂质过氧化的形成，二者间存在相互促进的关系，共同加速对局部病变组织的损伤，达到治疗的目的。 二、冷冻后细胞的形态变化 由于冷冻后细胞内渗透压的升高，可造成细胞膜的收缩，引起膜相分离、膜萎缩；线粒体则可明显增大、基质密度减少、消失等多种变化；内质网可呈现出结构不清，张力原纤维失去成束状态而断裂和融合成斑块状；细胞核在冷冻后的变化最为明显，核内染色质可呈浓缩状态，分布不均，核内可见冰晶空泡，核膜可见破裂，还可观察到核固缩、核溶解等现象，整个核的面积缩小；有研究发现细胞冷冻后胞浆内的中间丝分布发生紊乱，原来着色均匀的细胞呈现出丝网状和斑块状，这间接反映了冷冻后细胞浆内各种成分的分布和排列发生紊乱；细胞连接在冷冻后也常发生破坏、变性、坏死。这种细胞连接的改变具有重要的临床意义，冷冻能使血管内皮细胞紧密联结开放，同时血管通透性短期内迅速增加，导致抗癌药物能顺利进入瘤区，从而增加肿瘤组