蛋白质工程--3蛋白质的修饰和表达幻灯片.ppt

如何改善外源蛋白的溶解性？ 外源蛋白的分泌表达 细菌生长温度：改善在细胞质中表达蛋白溶解性的最简单方法是在诱导过程中降低工程菌的生长温度（降低到30度或更低）；通过用较弱的启动子减慢蛋白合成速率或利用部分诱导条件也可防止蛋白的错折叠和聚集，而使大量可溶蛋白积累。 外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达 外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合：如与硫氧环蛋白、His6标签等功表达可以增加外源蛋白的溶解性。 1．表达载体的构建 (1) 复制起始点 (2) 选择性基因 (3) 启动子 (4) 核糖体结合位点 (5) 多克隆位点 (6) 转录终止序列 二、目标蛋白质在酵母细胞中的表达 1.有关酵母表达载体的复制、 转录、筛选元件 2.??外源mRNA在酵母细胞中的翻译 3.??外源蛋白质在酵母中的分泌表达 4.???外源蛋白质的翻译后修饰 三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达 1．选择哺乳动物细胞表达体系的优点 2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统 1．哺乳动物细胞表达体系的优点 哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。 哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。 实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。 分泌型哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。 哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处 是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质。如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。 2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统 在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，一是稳定表达系统。 瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。 稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。 其他表达系统 原核表达系统 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 还有昆虫表达系统 卵母细胞表达系统 转录一翻译偶联的无细胞表达系统 这些系统可根据具体需要来选择使用。 四、噬菌体显示(Phage display) 关于噬菌体显示的表达载体 噬菌体显示技术的操作 噬菌体显示技术的应用 第三章 蛋白质的修饰和表达 第一节 蛋白质修饰的化学途径 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达 第一节 蛋白质的化学修饰 凡通过活性基团的引入或去除，而是蛋白质一级结构发生改变的过程 影响因素： 1) 蛋白质功能基的反应活性 基团之间的氢键和静电作用 基团之间的空间阻力 2) 修饰剂的反应活性 根据化学修饰剂与蛋白质之间反应的性质不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质的巯基、氨基和羧基等侧链基团进行修饰 蛋白质化学修饰的主要部位是蛋白质的侧链基团，通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的 一、蛋白质侧链基团的化学修饰 1）碘乙酸和碘乙酰胺 2）N-乙基马来酰亚胺：反应伴随光吸收的变化 1. 巯基的化学修饰 3）5,5-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB) 反应释放1个很强颜色的TNB阴离子，该阴离子在412nm具有很强的吸收 1）三硝基苯磺酸：与赖氨酸残基的ε-氨基发生反应形成氨