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孔雀石绿染料的微生物脱色研究 孔雀石绿（Malachite green） 别名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、苯胺绿、维多利亚绿或 中国绿，亦为一种生物染色剂染料。孔雀石绿过去常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品 颜色剂和细胞化学染色剂，1933 年起其作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产中使用，后曾 被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病。从上世纪90 年代开始，国内外学者陆续发现，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿具有高毒素、高残留、高致 癌和高致畸、致突变等副作用[1]。 许多研究表明，微生物具有极高的降解有机染料的能力，目前分离到的脱色微生物主要有真菌、藻类和细菌[2]。但目前已报道的脱色菌的效率不高，且耐受孔雀绿染料的范围较低[3,4]。 本试验以高浓度孔雀绿染料为筛选底物，从活性污泥中分离出脱色菌，，能耐受并脱色降解较高浓度的孔雀绿染料，脱色能力强，且脱色速率高. 1 实验设计方案与思路 1.1 活性污泥分离纯化 1.2 单菌种的扩大培养，在三角瓶中液体培养基培养 1.3 不同单菌种对染料的降解实验：在三角瓶的液体培养基中加少量染料溶液(1000mg/L）和活性污泥，摇床培养，测定脱色率。确定高效脱色菌种。 1.4 对菌种进行初步鉴定（菌种的形状、革兰氏染色） 2 实验方法[5] 2.1 活性污泥分离纯化 配培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，NaCl 5g，pH:7.0~7.2，15-25g/l琼脂，配置的时候先配液体培养基，再加琼脂配固体培养基，然后分装成六个液体培养基（每个约100ml）和一个固体培养基，塞上棉塞，包扎好，待灭菌。把实验要用到的实验仪器用报纸包好，用细线扎好，连同培养基一起放入高压蒸汽灭箘法灭菌。 倒平板 经灭菌后的固体培养基冷却至50摄氏度左右倒入3个无菌培养皿中，冷凝成平板。 稀释样品 将1瓶90 ml和5管9 ml的无菌水排列好，按10-1 、10-2 、、、10-6依次编号。在无菌条件下，用10 ml的无菌移液管吸取10 ml活性污泥，至于90 ml无菌水（内含玻璃珠）中，将移液管吹洗3次，用手摇10 min 将颗粒状样品打散；用1 ml 无菌移液管吸取1 ml 10-1 浓度的菌液于9 ml的无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀，即为10-2 浓度菌液。同法依次稀释到10-6。 涂布 用无菌移液管吸取5ml浓度为10-4 、10-5 、10-6稀释样品液于平板上，用三角刮刀在平板上旋转涂布均匀。 培养 将已涂布的平板置于恒温培养箱培养，正置培养两天。 2.2 对菌种进行初步鉴定 结果观察 观察培养出的3种菌落 镜检 将培养出的3种菌落进行革兰氏染色，并判断它们的菌属 2.3 单菌种的扩大培养 将沾有上述3种菌种的接种环分别送入3个液体培养基中（锥形瓶编号1-3），使环上的菌种全部进入培养基中，抽出接种环并灼烧。轻轻摇动，使菌体在液体培养基中分布均匀，送培养箱37度摇床培养六天。 2.4 不同单菌种对孔雀绿的降解效率测定 配制1000mg/L孔雀绿染料，在617nm下测定孔雀绿染料的吸光度A0 分别取少量（数滴）孔雀石绿染料溶液加入上述3个液体培养基中，再把三个培养基放入恒温振荡器摇床培养两天。每个培养基分别取混合液50 ml于离心管进行离心分离15min，再分别测定降解后孔雀石绿染料的吸光度A1-A3，计算染料溶液的降解率。 3 结果与讨论 3.1 降解后孔雀石绿的吸光度 菌落颜色 浅褐色A 深褐色B 白色C 空白对照 吸光度A 0.275 0.380 0.278 0.785 透光率T 53.2% 42.0% 52.9% 16.4% 3.2 菌种的初步鉴定结果 菌种 观察结果 革兰氏染色结果 细菌A 表面干燥，呈草帽状，边缘呈锯齿状，颜色呈淡褐色，中间颜色较深，背面颜色较深 紫色，为革兰氏阳性菌 细菌B 表面湿润，平滑，中间突起，呈圆形，边缘呈波浪形，颜色呈深褐色，中间颜色较深 红色，为革兰氏阴性菌 细菌C 表面湿润，呈圆形，边缘整齐，颜色呈白色 紫色，为革兰氏阳性菌 3.3 菌种的降解效率对照 菌种 降解效率 A 64.97% B 51.59% C 64.58% 3.4 结果讨论 由上述结果与分析可知，对于少量高浓度孔雀石绿，菌种A和C的脱色作用相对来说较强。 菌种对于高浓度孔雀石绿的脱色作用不是很明显，后续的实验可适当降低浓度以更符合实际情况。 后续实验可研究pH、温度和脱色时间对菌种脱色作用的影响，使得菌种的脱色效率更好。 4 参考文献