激光扫描共聚焦显微镜dabian讲解材料.pptVIP

;一、简介;它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化,成为形态学、分子生物学等领域中新一代强有力的研究工具。 激光扫描共聚焦显微镜在材料科学、地质科学等工业工程方面也有着广泛应用。; 激光扫描共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，有探测针孔后的光电倍增管（PMT）或冷电感耦合器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视屏幕上形成荧光图像。 照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面。 在显微镜的载物台上加上一个微量步进马达，可使载物台上下步进移动，最小步进距离现在已达到10 nm，则细胞或组织各个横断面的图像都能清楚的显示，实现了光学切片的目的。;Fluorescent Microscope; 荧光显微镜的缺点: 1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的同时采集 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作. 5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度. 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠 ;Confocal vs Nonconfocal;高分辨率的扫描,强大的ZOOM 功能, 精细的观察;时间分辨和快速扫描动态图像;二、基本结构:;结构示意图;激光共聚焦显微镜的应用; ;Hela green-中心体 red- 纺锤体;定位、定量研究中常用荧光探针 1.Amine-Reactive Probes 与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等 FITC 异硫氰基荧光素 (四甲基异硫氰基罗丹明) 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 Alexa Fluor 488 488/530 PE (藻红蛋白) 565/578 Texas Red (德州红) 595/615 Cy3 490/530 BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618 ;1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白 免役荧光标记： 与抗体耦联, 直标: 一抗+荧光探针 间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白( 抗 tublin抗体+荧光探针) 肌动蛋白 (Palloidine+荧光探针) 2)细胞膜表面受体 配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2) 标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC ; 2.标记细胞器荧光探针 1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子性,可检 测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留 时间短 JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光 线粒体膜电位高时为多聚体 490/590 发红光 可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电 位最佳探针 Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 ,