质谱分析技术与蛋白组学MassSpectrometryand.ppt

新序列推测原则软件辅助分析 找出最佳路径 一个峰不能使用两次，连续前进或者退后。 简单肽段模式 软件辅助分析（上网利用相关网站的软件和数据库） 六、质谱分析技术在医学生物学中的应用1、蛋白质鉴定： 用于多肽，蛋白质的分子量测定外，还广泛的应用于肽指纹图谱测定及氨基酸序列测定。1）直接通过末端氨基酸序列分析鉴定蛋白质2）结合肽谱数据库鉴定蛋白质（肽质量指纹谱）3）蛋白质修饰鉴定 用MALDI-TOF MS检测特定部位氨基酸残基的磷酸化 4）分子量测定： MALDI-TOF 的准确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前常规应用的SDS 电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达300KDa。 5） 另外分子量测定还可以提供分子结构信息：（1）分子式(样品的元素组成)用同位素丰度比法（低分辨法）或高分辨质谱仪测得的准确相对分子质量，均可以确定分子式；（2）鉴定某些官能团如甲基(m/z 15)、羰基(m/z 28)、甲氧基(m/z 31)、乙酰基(m/z 43)……（3）分子结构信息由分子结构与裂解方式的经验规律,根据碎片离子的m/z 及相对丰度RA 提供分子结构信息。 2、质谱峰图谱比较：用于混合物比较 如血、尿、分泌液中的代谢物（ 大分子和小分子）等改变的监测，可以用于生物标记物分析鉴定，作为生物药材的鉴定，监测疾病过程，治疗效果，预后评价，各种生理病理过程研究的监测和评估3、质谱分析方法的选择 1）质谱峰图谱比较： SELDI-TOF MS 2 kDa – 50 kDa MALDI-TOF MS 0.8 kDa – 300 kDa 2）蛋白质鉴定： MALDI-TOF MS PMF 串联质谱（MS-MS）氨基酸序列分析 七、基本过程与样品制备注意事项 （一）基本过程 1）蛋白质分离纯化： 还原和巯基封闭（烷基化） 等电聚焦-SDS PAGE电泳（500-10,000个点） 混合HPLC层析直接接MS分析（用IEX/RPC方法可以产生~2,500洗脱带） 对SELDI-TOF MS溶解蛋白质直接加在蛋白质芯片上 2）胶染色，图像分析（比较找差异，双染色如Cy3、Cy5染色），含蛋白胶切取（前后图像对照）。以上各个步骤在自己的实验室完成 3）胶内蛋白酶限制酶切，从此步骤可由公司完成4）肽段提取纯化，点样5）质谱分析数据获取（质谱仪器分析）6）数据信息解读 人工：氨基酸序列分析（可以自己人工分析） 软件处理：蛋白质鉴定、氨基酸序列分析网站：/tools/#proteome 可以选择转向相关网站软件：MASCOT等适用于PMF和氨基酸序列分析数据库：MSDB、NCBInr、SwissProt （二）样品制备注意事项 1）防止蛋白质降解 2）需要还原与烷基化处理 3）电泳胶块处理过程中（取胶、染色、切取胶块等），不可皮肤直接接触，和头皮削掉落其上。 4）切胶前后留胶的图像 5）送作质谱分析样品达到必须的浓度 6）有可带电荷基团、适当的pH值、不含各种去污剂、DMSO、DMF、甘油、磷酸盐、 其它盐和缓冲剂 100 mM。 The following components are ACCEPTABLE  Acetic or formic acid, Acetonitrile, ethanol, Guanidine/HCl 4M, Hexafluoroisopropanol up to 40%, Methanol, Sodium chloride 10 mM, Urea 1M 八、质谱数据分析软件使用（以Mascot为例） ExPASy Proteomics Tools Matrix Science主页 PMF分析 MS/MS分析 质谱分析技术与蛋白组学Mass Spectrometry and Proteomics2011-05-03 一、什么是蛋白组学？ 研究生物各个水平、状态的全部蛋白质组成的质量和数量上的变化。 水平：个体、组织、细胞、细胞器、复合体 状态：细胞周期、生理、病理状态、环境变 化、信号转导、蛋白质相互作用等 二、为什么要进行蛋白组研究？ 蛋白组学要解决的问题。 1）蛋白组研究的起因：一般性原因