免疫设计性实验.docx

2.材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物小鼠20只,雌性,6周龄2.1.2实验细胞株及质粒小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株,小鼠成纤维细胞株,小鼠肥大细胞瘤细胞株;载体质粒,以质粒为载体、含HBcAg基因全长的重组质粒PcHB2.1.3实验试剂2.1.3.1主要试剂RNAisoReagent、PrimeseriPtRTReagentKit、TaqDNA聚合酶、DNAMarker、限制性内切酶BamHI和EcoR1、T4DNA连接酶、DNA片段纯化试剂盒、凝胶回收纯化DNA片段试剂盒、SYBR荧光定量PCR试剂盒、AttracteneTransfectionReagent、质粒提取试剂盒、四甲基偶氮哇(MTT)、牛血清白蛋白(BSA)、刀豆蛋白A(conA)、小鼠IL-2Pe、poly(dAT:dAT)、小鼠TBK一1抗体及二抗、蛋白裂解液、PMSF、HBcAg、HBcAg特异性多肤、抗一HBc ELISA试剂盒、小鼠IFN-Y及IL-4 ELIsA试剂盒、LDH细胞毒性检测试剂盒、小鼠IFN一pELIsA试剂盒2.1.3.2常用试剂配制l)PBs缓冲液:称取NaCl 8.0g ,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g,溶于800ml双蒸水中,调节溶液PH至7.2,加双蒸水定容至1000ml,高压灭菌20分钟,室温保存。2)细胞消化液:称取胰蛋白酶0.25g,EDTA 0.02g,溶于100mlPBS溶液中,0.22μM滤器过滤除菌,4℃保存。3)LB液体培养基:蛋白脉10g,酵母提取物5g,Nacl 10g,溶于800ml双蒸水中,用10N NaOH调节PH至7.4,分装,高压灭菌,冷却后于4℃保存。4)LB固体培养基:每100m1 LB液体培养基中加入1.5g琼脂粉,高压灭菌20分钟,倾倒平板冷却后于4℃保存。5)Hank`S液:称取NaCl 5.0g,Na2HPO4·12H2O 0.12g,KH2PO4 0.06g,KCl 0.4g,葡萄糖1.0g,溶于900ml双蒸水,调节PH值至7.2-7.4,灭菌后分装,4℃保存。6)红细胞裂解液:称取NH4Cl 8.29g,KHCO3 1.0g,Na2EDTA 37.2mg,溶于1L双蒸水中,混匀,调节PH至7.2-7.4,灭菌后分装, 4℃保存。7)淋巴细胞培养基:50μM β一琉基乙醇,1μM丙酮酸钠,10μM HEPES,30U/mL IL-2加到500μL RPMIl64O完全培养基中, 4℃保存。8)50X TAE电泳缓冲液:称Tris 242g,冰乙酸57.lml,0.5mol/L EDTA l00ml,加去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1L,高温高压灭菌,室温保存。9)1%琼脂糖凝胶:取0.5g琼脂糖加入锥形瓶中,加入50mL1X TAE缓冲液,混匀后置于微波炉中加热1分钟,取出后冷却至60℃时加入2.5μL澳乙锭,混匀后将其缓缓倒入装有梳齿的制胶槽中,约20-30分钟凝固后即可取出使用。2.1.4引物及多肤合成2.1.5主要仪器设备-80℃超低温冰箱、4℃-20℃低温冰箱、6孔、24孔、96孔细胞培养板、Milli-Q去离子水机、pCR仪、超净台、电泳图像分析系统、电泳仪、电子天平、低温高速离心机、二氧化碳培养箱、核酸蛋白仪、电热恒温水槽、普通离心机、高速离心机、普通光学显微镜、微量移液器、荧光显微镜、紫外微量分光光度计2.2实验方法2.2.1细胞培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株,小鼠成纤维细胞株,小鼠肥大细胞瘤细胞株均采用含10%小牛血清的高糖DMEM培养基,在37℃,5% CO2培养箱中培养。2.2.2 TBK-1真核表达质粒PcTBK-1的构建2.2.2.1细胞总RNA的提取弃去培养液后,细胞用1XPBS清洗一次。每10cm2细胞中加入lml RNAisO Reagent,使裂解液均匀分布于细胞表面,吹打细胞使其脱落,转移至1.5ml离心管中,室温静置5分钟。加入氯仿200μl,震荡混匀,室温静置5分钟。12000g 4℃离心5分钟,吸取上清至一新的离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀后室温静置10分钟。12000g 4℃离心10分钟,弃去上清后缓慢沿管壁加入75%乙醇lml,上下颠倒洗涤离心管壁, 12000g 4℃离心5分钟。弃去乙醇后室温干燥沉淀2-5分钟,加入适量RNase-free水溶解沉淀,于-80℃保存。2.2.2.2 RNA反转录为cDNA以提取的RNA为模板,在Microtube管中配制如下混合液:模板RNA 4μL(<5μg)0Lig0 dT Primer(50μM) lμLdNTP Mixture(1omM each) lμLRNase-free dH2O up to 10μL 65℃水浴5分钟后迅速冰