实验四 基因表达检测的相关实验技术和蛋白印迹技术 2014.10.15-2.ppt

蛋白印迹技术（western blot） 蛋白印迹技术又称免疫印迹技术或western印迹技术，是鉴别蛋白质的分子杂交技术 原理： 1.将经过SDS分离的蛋白质样品转移到固相载体上。 2.以固相载体上蛋白质或多肽作为抗原，与对应的未标记的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗反应。 3.经过底物显色、化学发光或放射自显影，检测特异基因表达的蛋白成分的存在和含量。 该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【基本原理】 【Western Blot 流程】 蛋白样品的制备 SDS转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 目的：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体和或检测试剂有交叉反应。 常用的封闭试剂有1-3%的BSA或者5%的脱脂奶粉，缓冲液一般选择PBST或者TBST。其中的Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景。 封闭液：5%的脱脂牛奶，TBST配制（室温摇床孵育1小时） TBST含有0.1%Tween20，不影响抗体与抗原的结合，有助于去除非特异性的结合，减少背景的干扰。 注意： 1. 膜正面朝上 2.进行下一步之前请用 1xTBST溶液清洗3次，每次10min 【Western Blot 流程】 蛋白样品的制备 SDS转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 目标蛋白注射入第一动物模型 动物产生抗目标蛋白的抗体，纯化（一抗） 将第一动物模型产生的抗体注射入第二动物模型使其产生的抗体，经纯化(二抗), 再用酶或同位素标记。 PVDF膜用TBST溶液清洗完后，放入含1：10000稀释的一抗溶液中（用TBST溶液稀释），室温至少1h或4oC过夜。 回收一抗放置4oC保存，用1xTBST溶液清洗PVDF膜3次，每次10min 【Western Blot 流程】 蛋白样品的制备 SDS转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 PVDF膜放入1：3000倍稀释的HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗溶液中（用TBST稀释），置室温摇床1h。 1xTBST清洗PVDF膜3次，每次10min 1xTBST清洗PVDF膜3次，每次10min 【Western Blot 流程】 蛋白样品的制备 SDS转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 1. 放射自显影 2. 底物化学发光ECL 3. 底物荧光ECF 4. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色 Western blotting 蛋白显影方法 在Ecl底物中，含有鲁米诺（溶液A）和 H2O2 （溶液B），在HRP（辣根过氧化物酶）催化剂的作用下， luminol和H2O2反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，并发出荧光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。 HRP只是起催化作用，并不消耗，所以是可以重复加ECL反应液进行 观察。 增强化学发光法(ECL) 显色原理：氨基苯二酰肼类：主要是鲁米诺（luminol）及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。 显色原理 取化学发光液A、B各0.5ml等量混合，直接加在PVDF膜上，反应2-5 min。 在化学发光检测仪上观察并记录实验结果。 Western blotting 示意图 1. 剪膜，检测蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），大小约为36kDa，因此根据预染蛋白marker提示剪取36kDa上下共约3条预染蛋白大小宽度。 甲醇激活， TBST漂洗。 2. 封闭（封闭液：5%脱脂牛奶，TBST），室温，1小时。TBST淋洗。 3. 一抗反应，室温孵育，1小时 4. 洗涤：TBST，3次，每次10min 5. 二抗反应，室温孵育，1小时 6. 洗涤：TBST，3次，每次10min 7. ECL显色：A，B化学发光液各0.5ml混合，放入膜，反应2min后于化学发光检测仪上进行观察 此次实验 注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致曝光不足，影响条带亮度，过长会导致荧光信号衰弱，也会使背景颜色加深。 * * * *