实验一 DMD基因突变检测20131120.ppt

教师:俞萍 Email:pingyu@zju.edu.cn 电话实验一 进行性肌营养不良症（DMD）基因检测 进行性肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力。 本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。 Genetics of DMD OMIM# 310200 occurring in about 1 in 3500 males, X-linked recessive, lethal in males, 1/3 of patients are new mutants; 2/3 have carrier mothers, Gene location Xp21, large gene (more than 2000 kb), 79 exons. High mutation rate, 60% to 65% of the mutations are deletions, and about 6% are duplications , Allelic mutations in the same gene cause a milder disorder, Becker muscular dystrophy. DMD突变可以导致两种肌营养不良 DMD, (Duchenne muscular dystrophy) 缺失或重复引起读框改变（frame shift），导致无蛋白表达或表达无功能的蛋白，症状严重。 BMD, Becker’s muscular dystrophy 缺失或重复不引起读框改变，产生有部分功能的蛋白质，症状轻。 多重PCR（Multiplex PCR）检测 DMD外显子缺失 在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增不同的靶DNA片段。 * * 整体实验安排 实验一 进行性肌营养不良症（DMD）基因检测 实验二 人类外周血染色体标本制备 实验三 遗传病基因突变分析 （SSCP） 实验四 人类染色体Ｇ带标本制备及观察 实验五 人类染色体核型分析 1. 进行性肌营养不良症（DMD）基因检测 2. 人类外周血染色体标本制备 3. 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）加样（实验三 ） 第一次 实验内容 Duchenne Muscular Dystrophy, DMD DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显子组成，编码3685个氨基酸、分子量为427 kD的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。 抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。 本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子，其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。 DMD基因4个外显子的引物顺序： 外显子 PCR产物大小 引物F 引物R 8 360 gtcctttacacactttacctgttgag ggcctcattctcatgttctaattag 19 459 ttctaccacatcccattttcttcca gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc 45 547 aaacatggaacatccttgtggggac cattcctattagatctgtcgccctac 48 506 ttgaatacattggttaaatcccaacatg cctgaataaagtcttccttaccacac