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实验报告
课程名称: 分子医学实验 指导老师: 孙启明 成绩:
实验名称: 层析技术(纸层析、薄层层析、离子交换层析)同组学生姓名: 阮烨玲
一、实验目的和要求(必填)
三、主要仪器设备(必填)
五、实验数据记录和处理
七、讨论、心得
二、实验内容和原理(必填)
四、操作方法和实验步骤
六、实验结果与分析(必填)
纸层析法——转氨基作用验证
实验目的和要求
1、了解纸层析技术的基本原理。
2、掌握纸层析法。
二、实验内容和原理
体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转移酶的作用下,移换至α-酮酸的过程,称氨基移换作用。此类酶各有一定的特异性,普遍存在于动物各组织中。
本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肝匀浆中的谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基移换反应,然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。其反应过程如下:
由于谷氨酸、丙酮酸在肝匀浆中可循其他代谢途径分解和转化,影响氨基移换过程的观察,因此在反应体系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。
三、试剂、器材与实验材料
试剂:1%谷氨酸钾溶液、1%丙酮酸钠溶液、0.25%一碘醋酸钾溶液、5%HAc溶液、0.01mol/L,PH7.4磷酸缓冲溶液、展开剂、0.1%丙氨酸溶液、0.1%谷氨酸钾溶液0.1%茚三酮乙醇溶液
器材:烘箱、剪刀、镊子、天平、研钵、滴管、烧杯、恒温水浴箱、10cm*20cm层析滤纸、层析缸、喷雾器、电吹风机、15mm*100mm试管及试管架
实验材料:小白鼠
操作方法和实验步骤
1、肝匀浆的制备
取小白鼠1只,颈椎脱臼法处死后,取出肝脏,经0.9% NaCl溶液洗去血污后,称取肝脏约1 g,置研钵中加入玻璃砂少许(或用玻璃匀浆器研磨),然后加0.01 mol/L,pH=7.4磷酸缓冲溶液1ml磨成匀浆,之后再加入4ml磷酸缓冲液。
2、转氨酶反应
取短离心管2只编号(1、2),各加肝匀浆10滴,先将2号管置沸水浴中5分钟。两管各加1%谷氨酸钾溶液10滴,1%丙酮酸钠溶液10滴,0.25%一碘醋酸钾溶液5滴,同置40℃水浴中保温30分钟。取出,向两管各加5% HAc溶液2滴,再同置沸水浴中5分钟,冷却后离心(2000 r/min,5 min),将上清液移入另外同样编号的1.5ml小塑料离心管中备用。
3、层析验证
在10 cm×20 cm滤纸上,距短边2.5 cm处用铅笔轻轻画一线(原线),在原线上,每隔1.5cm处用铅笔作记号,并在线下底边注明1、2、谷氨酸、丙氨酸记号。用毛细管分别吸取1号液、2号液在层析滤纸上点样,注意斑点不可太大,一般直径约0.3 cm为宜,约5 min等干后,在1、2号原点上,再重复点两次次(注意,不可调错),然后分别点上谷氨酸、丙氨酸,作为对照,干后置层析缸中展开1.5~2h。(注意:点样处切勿浸入展开剂中。)取出滤纸晾干,喷以0.1%茚三酮乙醇溶液,电吹风吹干,观察层析出现的斑点并解释之。
五、实验结果
转氨基作用纸层析得到的斑块形状呈向外火舌状,上端尖锐下端较钝,略呈三角状。分析原因亦可能是抖动引起,流动相与固定相都容易受震动,产生上升时速度不匀。
标准组3、4号分别为Glu和Ala,其中Glu层析出的点在下方,Ala在上方。
1号对照组仅出现与谷氨酸高度相同的斑块,无丙氨酸。
2号实验组出现两种高度的斑点,高度与3、4号对应,说明Glu与Ala同时存在。
分析:1号中酶沸水浴变性不能实现转氨基作用,结合1号出现Glu与Ala两块斑点,转氨基作用得到验证。
讨论
1.点样三次,毛细管末端如果有破裂点样会有困难。
2.点样处勿进入展开剂中,否则样品会溶解在展开集中,影响实验结果。
3.不同组的层析板或纸不要有接触以免相互污染。
4.纸层析法是以纸为载体的分配层析法。一般以滤纸纤维上吸附的水分为固定相,由水饱和的相对于固定相流动的有机溶剂为流动相。因此,纸层析也可以看作是溶质在固定相和流动相之间连续萃取的过程。如果混合物中的各种成分在溶剂之间的分配系数足够大,它们就得到分离。样品经层析后,常用比移值Rf(ratio of fronts)来表示各组分在层谱中的位置。Rf值与待分离物质的性质存在一定关系,在一定条件下是常数。
5.纸的选择和溶剂的选择:Whatman1号滤纸常用于分析性的工作;较厚的Whatman3MM滤纸,最好用于大量物质的分离。但其分离效果较1号纸差;Whatman4号和5号滤纸用于快速分离,但斑点边缘不清。选择溶剂与选择滤纸主要凭经验,取决于要研究的对象,所选溶剂最好能使样
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