生物化学-第十四章 基因重组和基因工程.ppt

分：分离目的基因 切：对目的基因和载体适当切割 接：目的基因与载体连接 转：重组DNA转入受体菌 筛：筛选出含有重组体的受菌体 DNA克隆的基本过程 小 结 * 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 * 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 * 1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白 * 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、不经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2. 真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞 * 表达载体pFASTBACI 的物理图谱 * * 三、重组技术与医学的关系 疾病相关基因分析 制造生物活性蛋白质 基因诊断与基因治疗 遗传疾病的预防 * 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 * 基因治疗 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 * 重症联合性免疫缺陷综合症（SCIDs）。 腺苷脱氨酶（ADA） * 1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性 遗传疾病的预防 * 小结 基本概念：限制性核酸内切酶 基因工程的基本过程：分，切，接，转，筛，表达 理想质粒载体的特点 * * * * * * * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 其他 * 克隆载体(cloning vector) 用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变 表达载体(expression vector) 在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物 载体类型 根据具体实验需要选择载体 * * （三）外源基因与载体切割与连接 催化连接反应的酶：DNA连接酶 * DNA连接酶 使一段DNA的3’-羟基末端与另一段DNA的5’-磷酸末端生成3’，5’-磷酸二酯键，使单链DNA缺口封合或使两个DNA片断连接成一个片断 —— “分子缝合针” * 根据酶的来源不同，分为两类： 1. E.coliDNA连接酶：大肠杆菌，只能连接互补的粘性末端。 2. T4连接酶：T4噬菌体，既可以“缝合”双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。 * 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 1. 粘性末端连接 * Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 * 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 * 2. 平端