饮料中咖啡因的高效液相色谱分析.pdfVIP

实验21 高效液相色谱法测定饮料中咖啡因 【实验目的】 1. 熟悉反相色谱法的工作原理和应用； 2. 学习液相色谱仪的基本结构和基本操作； 3. 掌握高效液相色谱法定性、定量分析的原理和方法。 【实验原理】 1. 基本原理 色谱法的实质是一种物理化学分离、分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分 配系数的差别，经过反复多次的分配实现组分分离。根据各组分在色谱图上的保留时间 （或保留距离），可直接进行组分的定性分析；测量各峰的峰面积或峰高，即可作为定 量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定相应组分的含量。 高效液相色谱法 （HPLC ）是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱理论，并 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器从而实现分离分析的方法。根据 使用的固定相及分离机理不同，高效液相色谱法分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱 法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 （1）正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相 对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、 三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、 胺类、羰基类及氨基酸类等），被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱。 （2 ）反相色谱法一般用非极性固定相（如 C 、C ）；流动相为水或缓冲液，常加 18 8 入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用 于分离非极性和极性较弱的化合物，被分离组分按极性从大到小的顺序流出。 液-液分配色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物 等。反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC 应用的80% 左右。 2. 咖啡因 咖啡因又称咖啡碱，由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层， 使人精神兴奋，被广泛应用于食品、饮料的生产工艺中，成为各种功能性饮品的重要成 分之一。对饮料中咖啡因进行有效分离与准确测定将有助于对饮料的生产工艺、产品质 量进行准确监控，不仅有利于产品真伪的辨别，同时也有利于引导人们对功能性饮品进 行正确消费。各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准，美国、加拿大、阿根廷、日 本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200 mg·L-1，南斯拉夫规定不得超过120 mg·L-1 ，到目前为止我国仅允许咖啡因加入到可乐型饮料中，其含量不得超过 150 -1 mg·L 。 本实验采用C18 反相液相色谱柱进行分离，以紫外检测器进行检测，以咖啡因标准 系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线，再根据样品中的咖啡因峰面积，由工作曲 线算出其浓度。 【仪器与试剂】 1. 仪器 1) Agilent 1100 高效液相色谱仪；2) VWD 检测器；3) Agilent ZORBAX SB C18 色谱 柱（15 cm×4.6 mm ，5 μm ）；4 ）超声波清洗器；5 ）超纯水机。 2. 试剂 1) 甲醇 （GR ）；2) 超纯水 （18.2 MΩ ，使用前超声波脱气）；3) 咖啡因标准品 （含 量98.0% 以上；4) 市售可口可乐。 【实验步骤】 1. 色谱条件参数的设置 流动相：甲醇:水(50:50) ；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：273 nm ；柱温：25 ℃； 进样量：10 µL。 2. 标准溶液的配制 准确称取的咖啡因对照品5.70 mg，适量水溶解后，定容在50 mL 容量瓶中，配制 成对照品溶液，其咖啡因对照品溶液的浓度为114 mg·L-1 。 3. 样品预处理 取一定量的可乐进行超声处理，超声时间为15 min 。在50 mL 容量瓶中，准确移取 取超声后的样品溶液10 mL，用超纯水定容，备用。 4. 标准曲线的绘制 待记录仪基线稳定后，分别注入不同体积的标准溶液1.0 μL、2.5 μL、5.0 μL、7.5 μL、 10.0 μL，记录色谱图中咖啡因的峰面积与保留时间，以峰面积对各组分的浓度绘制标准 工作曲线，得出线性方程。 5. 样品含量测定 在同样色谱条件下，注