大学生创新创业训练项目中期检查书项目名称产细菌素芽孢杆菌.DOC

大学生创新创业训练项目中期检查书 项 目 名 称 产细菌素芽孢杆菌、乳酸菌的筛选 及其复合代谢物抑菌活性研究 项 目 编 号 201410759047 项目负责人 孙慧芹 所 在 学 院 食品学院 资 助 总 额 0.8 万元，已拨款 0.8 万元 起 止 年 月 2013年11月-2015年5月 电 话 E-mail 996524898@ 填 表 日 期 2014年12月10日 石河子大学填 写 说 明 1．中期检查报告由正文和附件两部分组成，正文部分请按表格要求填写，并可根据需要加页，要求层次分明、内容准确。项目执行过程中的进展或研究成果、计划调整情况等，须在报告中如实反映。 2．对不按要求填报本中期检查书，或项目执行不力，或研究内容调整不当而影响项目顺利开展的，学校将中止拨款。 3．院系专家组认真评审，签署意见后，按时将本检查书(一式二份)报送项目管理办公室。一、项目主要进展（附已发表论文首页或其他成果的复印件） （一） 项目研究已完成如下工作 1. 项目前的资料查找搜集以及实验所需实验器材药品的申报； 2. 从猪肠道内容物以及乳制品中分离、纯化、筛选得到多株芽孢杆菌和乳酸菌； 3. 耐受性试验 对筛选出的芽孢杆菌进行耐受性试验（人工胃液、人工肠液）； 4. 初筛 对初筛得到的乳酸菌和耐受性强的芽孢杆菌做牛津杯法抑菌试验，指示菌有：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、李斯特菌； 5. 复筛 产细菌素乳酸菌的复筛，主要有：酸及酸性末端产物作用的检测与排除、过氧化氢作用的检测与排除； 6. 对已筛得的具有抑菌性的9株芽孢杆菌做滤纸片法测其对抗生素的敏感性，抗生素有杆菌肽、头孢、红霉素、四环素； 7. 对筛选得到的产细菌素的芽孢杆菌进行了形态鉴定，革兰氏染色并获得镜检图像。 （二）主要研究内容及成果 1.实验技术路线图 试样的采集 ↓ 芽孢杆菌、乳酸菌的筛选纯化 ↓ 芽孢杆菌耐受试验 ↓ 初筛（牛津杯抑菌试验) ↓ 乳酸菌复筛 ↓ 复合益生菌发酵液的抑菌活性试验 ↓ 2.芽孢杆菌及乳酸菌的分离及纯化 2.1芽孢杆菌预筛选和增殖培养 称取猪粪5 g,分装到5支灭菌生理盐（20mL）试管中,制备菌悬液：（配置0.85% 的生理盐水稀释液200mL，一个三角瓶放180mL，另取两只试管各放9mL）取用10-4和10-5菌液。每个稀释度吸取200 μL均匀涂布于芽孢杆菌培养基倒置培养：36±1℃，72h。 LBG（产芽孢杆菌的培养基）: 0.3%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%氯化钠 0.2%琼脂粉 .2乳酸菌的分离与筛选 取5克猪肠道内容物样品,用无菌生理盐水进行梯度稀释,选取1×10-2 、1×10-3、1×10-4、1×10-5四个稀释度，每个稀释度吸取200 μL均匀涂布于MRS固体平板表面，每个稀释度做两个平行,置于36±1℃培养3-5 d,挑取单菌落并连续3次划线分离，得到分离菌株。 MRS液体培养基:葡萄糖20ɡ/L; 蛋白陈10ɡ/L; 酵母提取物5 ɡ/L；柠檬酸二铵2ɡ/L; 醋酸钠5ɡ/L; 牛肉膏10ɡ/L;吐温801ɡ/L; K2HPO4 2g/L; MgSO4·H2O 0.058ɡ/L; MnSO4·H2O 0.25ɡ/L; pH6.8 。 2-3次得到纯的菌 株，并进行菌落形态观察。将菌株转入斜面培养基保存。将分离纯培养物进行接触酶实验和革兰氏染色，挑选接触酶阴性和革兰氏阳性的菌株，并用20%甘油保存于-80℃备用。 3.芽孢杆菌的耐受性试验 3.1 芽孢杆菌的人工胃液耐受性试验：取芽孢悬液10 mL,加入到90 mL人工胃液中,调整浓度至106 cfu /mL。置于37 ℃生化培养箱中培养3 h,然后进行平板菌落记数,以未经胃液处理的菌悬液作