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重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 细胞力学加载实验技术 实验指导教师： 吕 永 钢 学 院： 生物工程学院 专业及类别： 生物医学工程（学术型） 学 号： 20131902047 姓 名： 刘 玥 实验日期： 2014.3.27 成 绩： 重庆大学研究生院制 实验目的 ⒈ 学习细胞力学加载的基本原理及相关知识 ⒉ 熟悉Flexercell-4000操作流程和注意事项 实验仪器设备 材料：培养瓶，试管，移液管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，前交叉韧带（ACL）细胞。 仪器：Flexercell-4000 基底加载装置，C02培养箱，倒置显微镜，超净台，恒温水浴锅，4℃冰箱。 试剂：DMEM培养基，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。 实验原理 （1）基底形变加载技术 基底形变加载技术是用弹性膜作为基底材料，通过机械拉伸或利用气压，液压和机械接触引起弹性底面的形变，通过对基底材料加载后使基底材料的应变传递到细胞上,使附着于该底面的细胞受到牵引力，并可附加一些调节力周期的机械装置。通过该方式可产生循环或静止的单轴拉伸、循环或静止的双轴拉伸、循环或静止的等双轴拉伸。 （2）Flexercell-4000的实验原理 Flexercell-4000 基底加载装置，本实验采用美国Flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置（Flexercell-4000 tension），图1为其结构简图该系统是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜，形成负压而使培养膜产生拉伸应变，从而使黏附生长的细胞受到张力的作用。细胞所受力的大小正比于培养膜的牵拉幅度即应变率（%），整个加载装置放置于CO2孵箱内，加载程序由Flexercell-4000计算机软件自动控制。 Flexercell 4000柔性基底拉伸系统的组成： Flexercell-4000软件的计算机控制器（FlexCentral） 负压输出控制（FlexLink），真空源负压泵 真空基底板（BasePlate and Gasket），密封垫，加载平台 BioFlex培养板 BioFlex培养板为一次性，六孔板硅胶膜上均包被有不同的蛋白质或氨基酸。如胶原蛋白（collagen），弹性蛋白（elastin）等 图1 Flexercell-4000简易结构图 该系统用真空负压对生长中的细胞（组织）进行加载，加控制的静力或动力循环使膜变形，从而是贴在膜上生长的细胞（组织）也发生相应的变形，诱发细胞(组织)发生生物学变化。当只有BioFlex培养板时，基膜最大伸长可达到30%，有BioFlex培养板和加载台时，基膜的伸长可过20%。可以使用Flexercell拉伸加载系统进行试验的细胞或组织有很多，例如：肌肉、心肌、血管、肌腱、韧带、骨和软骨等。 Flexercell-4000柔性基底拉伸系统由Flexercell-4000计算机软件自动控制，用于施加不同的刺激参数。可设置的参数如下： 1.培养板膜的最小和最大伸长率（0-30%） 2.频率 3.加载波形：静力加载、正选波、心形波、三角波、方波和自定义波形 实验内容 1．人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。 2．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。 4．打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右。 5．将类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞接种于Flexercell-4000 基底加载装置特用的六孔板上，把六孔板置入Flexercell-4000配套的CO2培养箱进行培养，于孵箱内培养48h。 6．加载前将培养板中的旧液换成2%低血清新鲜培养液。每孔随机取点拍照。 7．在Flexcercell 4000软件上选择参数，参数如下：正弦波，min：0，max：12%,time:12h。 8．打开缓冲泵后，打开真空泵，然后启动加载。 9．加载结束后，关闭充气泵，再关缓冲泵，然后关闭电脑。 10．卸载后继续培养24h，每孔再随机取点拍照。 具体设备使用步骤： 1）、开启应力加载控制器、开启电脑 2）、开启FlexSoft FX-4000 软件，命名和设置参数 3）、将培养有细胞的细胞培养板放在应力加载平台上，盖紧，关闭培养箱。 4）、打开气体阀门装置。先开泵管，再开阀门 5）、点击“start”，运行软件 6）、运行软件过程中，若实时参数与预设参数有误差，点击“stop”，将培养箱中的细胞培养板和应力加载平台尽可能盖紧，再运行软件。 7）、运行结束后，关闭气体阀门装置，先关闭阀门，再关闭泵管开关，关闭应力加载控制器，最后关闭电脑 注意事项： 1）、开启和关闭气体阀门装置时，注意顺序。防止装置损坏或发生意外