反相色谱不同配比流动相与容量因子值.ppt

液 相 色 谱 仪 的 使 用 高压输液泵 1.每次使用后要把泵中的含盐缓冲液洗干净，防止 盐的沉积，泵要浸在无缓冲液的溶液或有机溶剂 中。 2.使用HPLC级的流动相试剂. 3.使用不锈钢烧结吸液滤头. 4.用纯水或双蒸蒸馏水，流量3～5ml/分，冲洗15分 钟，冲洗时必须打开排放阀（逆时针拧松） 必须做! 使用输液泵的注意事项 液 相 色 谱 仪 的 使 用 高压进样阀 必须做! 每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐.防 止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子.冲洗方法见进样阀 说明书. 严禁用! 严禁使用气相色谱那样的尖头针进样. 根据情况定 在注射针前加装针式过滤器,防止样品中的微粒进入进样 阀. * 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 有机污染物的影响（一） 50ml超纯水的有机物污染状态 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 有机污染物的影响（二） “三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 有机污染物的影响（三） 典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第一步 开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第二步 为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第三步 从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第四步 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第五步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第六步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度方法开发实例 - 第七步 最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。 液 相 色 谱 分 析 液相色谱的检测模式 脉冲可以 可以 可以 有限制 不可 梯度淋洗 是 否 否 是 是 温度敏感 是 否 否 是 是 流速敏感 106 105 105 106 104 线性范围 皮克 皮克 纳克 纳克 毫克 灵敏度 选择性 选择性 选择性 选择性 通用 响应 电化学 荧光 紫外 电导 示差折光 项目 灵敏度、选择性、适应能力 液 相 色 谱 分 析 开发液相色谱分析方法 分辨率是色谱分析中主要考虑的因素。 在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率 之外，以下因素都要考虑。 1.灵敏度 5.成本 2.载样量 6.容易使用 3.分析速度 7.色谱柱寿命 4.溶剂消耗 8.效率 液 相 色 谱 分 析 液相色谱分析方法的建立1 建立液相色谱分析方法通常有以下几步： （1）分子量－在样品预处理或GPC分析时有用 （2）选择合适的液相色谱方法（正相、反相或其他）； （3）选择合适的色谱柱； （4）溶解度－选择流动相的条件 （5）官能团－有否离子化基团？保留特性如何？ （6）样品的基质－考虑是否要前处理，如何前处理 液 相 色 谱 分 析 液相色谱分析方法的建立2 续前一页 （7）选择合适的K’值的条件； （8）选择良好的峰位（a值）； （9）选择良好的色谱柱条件（N值）； （10）检测特性－是否有紫外吸收？荧光？ （11）用实测样品解决出现的特殊问题； （12）证实方法的正确性。 当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择；首选为不溶于水/有机混合液的亲脂样品，异构体混合物和制备HPLC 硅胶最好 流动相：有机溶剂混合液 色谱柱：氰基，二醇基，氨基，硅胶 正相 HPLC