心肌线粒体提取试剂盒.docVIP

心肌线粒体提取试剂盒 说明： 该试剂盒针对心肌组织的结构特点，特别提供适于从心肌组织中提取线粒体的溶液，可以快速简单的从动物组织中分离线粒体。 60ml ·保存介质（5×） 10ml 保存条件：4℃或-20℃保存，有效期。饥饿大于12小时，去除内的糖元和脂肪4 ℃存放； 每克心肌组织可得约10mg左右的粗制线粒体总蛋白，若需提高得率，可以将第一次的沉淀重复匀浆一次，最终的得率可提高约70%左右。 操作步骤： 将实验动物（大鼠）饥饿大于12小时，以去除内的糖元和脂肪断头处死，取下，放于蒸馏水中洗去血液用小剪刀将5ml～8如组织很少，可以增加介质的量将剪好的组织转移到预冷的玻璃匀浆器中，匀浆将匀浆离心，1500g 4 ℃离心10mins（Beckman JA-25.50转头建议1200g）； 取上清，13000g 左右4 ℃离心10min小心的获得沉淀，即为粗制线粒体取少量保存介质将沉淀悬浮起来，用较小匀浆器匀浆测定蛋白浓度。以大于20mgml为宜如需要提高得率，可将步骤5中的沉淀再次用步骤4中分离介质体积的一半重匀浆重复步骤5。得率可提高。 测定介质： 225mM 甘露醇70mM 蔗糖 1mM EDTA0.1% BSA 10mM 磷酸钾，PH7.4预热测氧仪30分钟，恒温 ℃； 调节氧电极，用保险粉测试电极探头在反应槽中加入测定介质，调节仪器将最大相对氧浓度值设定为20左右。介质量＝反应总体积（2～3ml）线粒体悬浮液体积琥珀酸体积ADP体积加入线粒体悬液，记录一段时间基线，加入外源底物琥珀酸二钠（0.2M）0ul。实验中有可能会发现曲线斜率很大，加入ADP后不能刺激呼吸，其原因可能是心肌线粒体中内源性ADP过高。若出现此情况，建议先采样一段时间（约500ms），待消耗掉内源性ADP，曲线变得比较平缓后，将最大相对氧浓度值设为20外源底物琥珀酸二钠（0.2M）0ul，此时曲线斜率应该没有太大变化。此呼吸态为IV态呼吸记录约两分钟后，加入ADP（50mM）8ul，出现III态呼吸，待ADP完全消耗后线粒体又恢复到IV态呼吸RCR即加入ADP时（III态）的呼吸速率与ADP耗竭后（IV态）的呼吸速率之比，反线粒体膜的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。 3 北京宝赛生物技术有限公司 产品说明书 TEL: 010/ 69 FAX: 010 Http: // E-mail: market@ biosea@163.com （本公司所有产品仅供科研使用）