动物细胞培养制药工艺汇.ppt

3、微载体培养 4、固定化培养 90年代以来, 医学界开始尝试以微胶囊作为基因重组细胞的免疫隔离和运载工具, 利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能, 治疗相关疾病。 微囊化人胰岛 培养15d 微囊化小牛肾上腺嗜铬细胞 培养0d 微囊化肝癌细胞 培养40d 不同放大倍数的海藻酸钙微胶囊的SEM 照片 不同放大倍数的壳聚糖/海藻酸钠微胶囊的SEM 照片 重组人红细胞生成素生产工艺 重组人红细胞生成素生产工艺 概述 细胞培养工艺 分离纯化工艺 概述 1、天然红细胞生成 2、EPO的理化性质 3、重组人红细胞生成素 4、rhEPO的表达研究 4、rhEPO的表达研究 CHO培养工艺 1、工程CHO细胞系 稳定转染的筛选培养 2、种子细胞制备 3、灌流培养 4、培养工艺过程控制 rhEPO的分离纯化工艺 1、初级分离 2、纯化精制 3、EPO的质控与活性检测 小 结 思考题 * * 5、生长类因子与激素 动物细胞培养的种类 1、天然培养基 2、合成培养基 血清（Serum）成分与作用 血清（Serum）成分与作用 血清（Serum）成分与作用 2、合成培养 3、无血清培养基 培养基质量的控制 1、培养用水质 2、缓冲液 Ca,Mg离子具有细胞凝集作用 3、生理盐水和平衡盐溶液 3、生理盐水和平衡盐溶液 4、氨基酸配制 5、NaHCO3配制 6、培养基灭菌 动物细胞培养技术 动物细胞培养技术 动物细胞生长和基质依赖性 动物细胞培养基本过程 动物细胞大规模培养方法 动物细胞生长和基质依赖性 1、生长基质 2、贴壁依赖性细胞 3、非贴壁依赖性细胞 4、兼性贴壁依赖性细胞 动物细胞培养基本过程 1、原代细胞培养 — 过程 2、传代细胞培养 — 过程 动物细胞大规模培养方法 1、单层贴壁培养 — 概念与过程 1、单层贴壁培养 — 特点 2、悬浮培养 是脾脏B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞 特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，大量分泌和高效表达。 应用：抗体药物生产。 （3）杂交瘤细胞系 动物细胞制药 表达系统 昆虫杆状病毒科核多角体病毒（载体）携载外源基因，感染昆虫细胞或幼虫（宿主），高水平表达外源蛋白质。 1983：苜蓿尺蠖核多角体病毒－秋黏虫细胞表达系统 1984：家蚕核多角体病毒－家蚕幼虫表达系统。 应用：生产抗体、试剂盒等。日本批准用家蚕系统生产干扰素已上市。 常用的昆虫表达系统： Sf21：来源于秋粘虫的卵巢细胞。容易放大，高效表达。 Sf9：从SF21中分离得到，最常用。抗机械剪切，无血清培养基的搅拌反应器中生长。 TN-5B1-4：来源于粉纹夜蛾。表达能力高，能悬浮培养。 5.2 昆虫表达系统 家蚕完成基因组测序（西南大学完成） 优点： 安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受FDA认可 易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快。 高量表达：强启动子，外源基因可超量表达； 高效表达：可容纳较大的外源基因（12kb），表达数个外源基因，如抗体，并且装配成有功能的分子。 缺点： 翻译后的加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，但与哺乳动物细胞不完全相同；蛋白质合成与加工不匹配，修饰效率可能不高，引起溶解性、稳定性、免疫性等变化。 重组率低，筛选困难，周期长，需要4－10d。 2、优点与不足 表达系统 对培养条件要求严格 对培养基组成要求高 天然结构与活性的药物 6.动物细胞的生产特征 对培养条件要求严格 1、温度 2、氧气 3、pH值 对培养基组成要求高 天然结构与活性的药物 生产工艺特征 17.2 基因工程动物细胞的构建 17.2.1 表达载体的设计与构建 17.2.2 转染与培养 17.2.3 筛选与鉴定 病毒载体： 牛痘病毒：构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：肿瘤基因治疗 (重组人p53腺病毒注射液；5型腺病毒载体DNA和人p53肿瘤抑制基因重组；术中、术后使用可消灭残留癌)。 杆状病毒:外源基因表达（昆虫）。 质粒载体：穿梭载体，细菌体内扩增，在动物细胞中表达。 选择标记，扩增系统。 17.2.1 表达载体的设计与构建 1、载体类型 动物细胞制药 细胞系构建 动物病毒启动子：SV40早期和晚期启动子、腺病毒晚期启动子、CMV立即早期基因启动子。 动物基因的启动子：高表达，延长因子EF-1α启动子、泛素蛋白C启动子、IgG启动子。 2、 启动子与复制子 启动子－－－编码药物基因－－－终止子，选择标记 动物细胞制药 细胞系构建 终止密码子: T(U)AA, T(U)AG,T(U)GA PolyA信号序列：不宜太长，避免能量过度消耗。 常用:SV40 polyA(131)、BGH的polyA(225bp)。 3、终止子 表达载体结构举例 化学方法：磷酸钙，树脂，DEAE-葡聚糖