菜花DNA的提取及二苯胺检测3.pptVIP

实验 菜花DNA的提取及二苯胺检测 一. 实验目的 学习DNA提取的原理及方法。 掌握二苯胺方法检测DNA 。 二 .实验原理 [二苯胺鉴定DNA的化学原理] DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。 1．核酸分离提取的原则 1）应保证核酸一级结构的完整性 2）排除其他分子的污染 A． 核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶 剂和过高浓度的金属离子 B．其他生物大分子如：排除其他核酸分子的污染 2. 核酸提取的步骤 1）破碎细胞（材料不同，方法不同） 匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。 2） 除杂质，提DNA 杂质：蛋白，多糖，脂类，DNase, RNA A. DNase的抑制：EDTA B.? 除RNA 酶法：加RNase 四. 实验步骤 （一）DNA提取 1，称取 菜花5g,用水清洗后，加入半勺石英砂粘磨,再加入10ml 0.14M/LNACL-0.15MEDTA该溶液，继续研磨至浆状， 2，上述研磨液加入２５％ＳＤＳ1毫升，６０℃保温，１０分钟（间或搅拌）．至溶液变粘稠。 3，上述溶液加入　５Ｍ／Ｌ的NaCL溶液5毫升　，搅拌３分钟　，再加入氯仿－异戊醇　１5毫升，振摇３分钟(轻微），分装4管，平衡后４０００转离心１０分钟，取上清液。 4，上清液加入2ml乙酸钠-EDTA溶液，加入　2倍　体积的９５％冰冻乙醇，用玻棒慢慢搅拌，可看见ＤＮＡ缠绕在玻棒上． 5.待DNA略干燥后，溶于1ml０.０１％　NaOH溶液。 五.实验结果 写出本次实验中提取DNA时每一步操作中所用试剂的目的和原理。 * * 在浓NaCl（1－2M）溶液中，DNA溶解度大，RNA溶解度小； 在稀NaCl（0.14M）中，DNA溶解度小，RNA溶解度大， 因此可利用不同浓度的NaCl溶液将DNA和RNA从样品中分开。 SDS可将核蛋白分离出来 调节pH：RNA能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而DNA对碱较稳定，所以提DNA一般要在偏碱的环境中提取，提RNA要在偏酸的环境中稳定。。 调节盐浓度(盐的分步沉淀)： C. 除蛋白 加去垢剂或变性剂:SDS等 用有机溶剂沉淀，除去蛋白：氯仿、异戊醇，酚 加蛋白水解酶：蛋白酶k D. 除糖，脂类 3.DNA提取注意事项 减少物理因素对DNA的降解。动作轻柔缓慢，尽可能不要剧烈振荡或搅拌. 三.实验试剂 1，5mol/L NaCl溶液; 2， 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液; 3，25% SDS 溶液； 4，24:1 氯仿－异戊醇混合液； 5，3mol/L 乙酸钠－0.001mol/L EDTA-Na溶液； 6，95%乙醇； 7，二苯胺试剂：A液：1.5克二苯胺溶解于100ml冰乙酸中,在加入1.5ml浓硫酸 ； B液：１.６%的乙醛 　　实验时，取12/6ml A液，滴入12/6滴B液，混匀使用． （二） 二苯胺法检测DNA 1.按照以下表格添加 沸水浴加热10分钟，冷却后观察颜色变化。 ? 试管1 试管2 DNA提取液 1ml 1ml NaOH溶液 二苯胺试剂 6ml（6ml A+6滴B） 6ml 六、实验结果分析讨论