染色体DNA的提取.docVIP

一、 目的 熟练掌握抽提细菌DNA的一般方法 二、原理 基因工程实验所需要的基因组DNA 通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA 非易事，细菌基因组DNA通常是个很大的环状态DNA，而在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA 分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。 另外制备的细菌染色体DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。 大肠杆菌染色体DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS 具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS 能与蛋白质结合成为R1—0—SO3 R2 —蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿:异戊醇抽提除去经洒精沉淀回收DNA。枯草杆菌染色体制备与上类似，但略加修改的方法要适合教学要求。枯草杆菌是格兰氏阳性菌，所以在SDS 处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁。溶菌酶是一种糖苷水解酶，它能水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β—1，4 糖苷键，有助于细胞壁破裂，破裂的细胞壁在SDS 的作用下溶菌，同时用蛋白酶K 消化蛋白质，能解离缠绕在染色体DNA上的蛋白质，然后加入一定量的醋酸钾，使蛋白质变性，通常离心除去，在这期间可加入核糖酸酶消化RNA，最后用乙醇回收DNA。三、材料 （一）菌株 大肠杆菌C600、枯草杆菌BR151。 （二）仪器 电泳设备、恒温水浴锅、低速离心机、恒温振荡器、紫外检测仪。 （三）器皿 玻璃离心管（10 毫升）、移液管（10毫升、5毫升）、微量取样器、烧杯、玻璃棒、试管、三角瓶 （四）试剂 （1）LB 完全肉汤培养液：1%蛋白胨 0.5%酵母粉 0.5%NaCl pH7.5。 （2）BY 培养液：1%蛋白胨 0.5%牛肉膏 0.5%酵母粉 0.5%葡萄糖 0.5%NaClpH7.5 （3）SET 溶液：20%蔗糖；50mmol/L Tris—HCl（pH7.6） 50mmol/L EDTA。 （4）20%SDS （5）饱和酚 （6）氯仿:异戊醇（24:1 V:V） （7）预冷无水酒精 （8）TE 溶液 （9）RNase溶液 （10）5mol/L 醋酸钾 （11）蛋白酶K 20mg/ml 四、实验步骤 1、取大肠杆菌C600单菌落于5 毫升LB培养液中，37振荡培养过液。 2、将上述菌液1%接种量接种于20 毫升LB 培养液中，37摇床振荡培养过夜。 3、已培养好的菌液，收集于10毫升的离心管中，在低速离心机上4000r/min离心10分钟，去上清，留沉淀菌体。 4、用5 毫升的SET 溶液悬浮细胞，加入20% SDS 1毫升，37下轻摇过夜，使细胞裂解。 5、加入等体积的饱和酚，上下轻轻摇匀，放置5 分钟后，在低速离心机上3500r/min离心10 分钟。 6、取上相，加入1/2 体积的饱和酚，1/2体积的氯仿异:戊醇，上下翻转均匀，3500r/min离心10 分钟。 7、取上相，加入等体积的氯仿:异戊醇，如第6步，离心。 8、取上相于一干净离心管中，另在一个50 毫升的烧杯中加入15毫升预冷无水酒精，把上述的上相液沿着玻棒慢慢倒入酒精中，并温和地搅拌以使DNA 附着于玻棒上。 9、挑起DNA，再放于干净的酒精中洗涤，然后把DNA溶于50 毫升TE 中，待测浓度。 （二）枯草杆菌染色体DNA 的抽提 1、在BY 斜面上划线活化枯草杆菌BR151。 2、挑一环已活化的BR151 菌株于20 毫升的BY培养液中，37摇床振荡培养过液。 3、过夜培养物，收集10 毫升于离心管内，在低速离心机上3500r/min离心10 分钟。 4、沉淀菌体加入0.75 毫升溶菌酶液（8 毫克溶菌酶/1毫升SET），振荡器上悬浮细胞，悬浮液移入1.5 毫升离心管，室温30 分钟。 5、在反应液中加入0.15毫升SDS溶液，蛋白酶K 溶液5 微升，37水浴10 分钟后转入75水浴5 分钟。 6、加入5mol/L 醋酸钾0.3 毫升，上下翻转均匀，置于冰上30 分钟，期间不时摇动。 于台式高速离心机离10000r