荧光定量PCR——伯信生物.pptVIP

荧光定量PCR 荧光定量PCR技术发展史 荧光定量PCR的概念 荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。 荧光定量PCR与普通PCR比较 ? 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 ? 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 ? 增加定量的精确性 全程监控，精确定量 ? 结果分析更快捷方便，无需电泳 Q-PCR -- 起点检测： -- 具有重现性，误差小 扩增曲线（primary curve） 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线。 荧光阈值（threshold） 基线(baseline)：一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号,即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。 荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值 -- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍, （机器自动设置）。 -- 手动设置：大于样本的荧光背景值 Ct 值(Cycle Threshold) Ct值：在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 Ct值可以确定初始模板量？ 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 荧光定量PCR检测方法 SYBR Green I优缺点 优点： 实验设计简单 -- 仅需设计两个引物 通用性好,成本低 -- 对DNA模板没有选择性 兼容熔解曲线 --鉴定有无PCR杂带、有无引物二聚体 Taqman 工作原理 探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，5’ 报告基团、3’淬灭基团） 完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭，没有荧光产生。 聚合酶的5’外切酶活性，报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光 Taqman法的优缺点 荧光定量PCR解析方法 绝对定量 检测起始模板数的精确拷贝数 相对定量 检测经过不同样本之间目的基因的表达差异 相对定量2 - △△Ct实例 应用实例——MicroRNA 荧光定量PCR TaqMan MicroRNA 分析方法发夹状引物的反转录荧光定量PCR MicroRNA 定量方法 Estimated synthetic miRNA input (lin-4) in RT based on OD: 707-71 copies 实验证明可达7个数量级的线性范围 Stem-loop RT-PCR miRNA assays 高度的重现性 未知样品拷贝数的计算： 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.29 X + 40.33 QuantityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies X= 20.5-40.33 -3.29 =6.03 相对定量 特点 选择内参基因 内参基因 GAPDH、 Actin、 18S rRNA 等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小 -- 文献检索 -- 实验筛选 内参基因 -- 同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。 -- RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。 对样本初始浓度差异进行均一化校正。 双标准曲线法 2 -△△Ct法 相对定量——两种常用的分析方法 假设条件： 内参基因和目标基因扩增效率不同 优点：实验优化简单 缺点：每一轮实验都必需做标准曲线 80% 相对定量——双标准曲线法 待测组目的基因平均Ct值 待测组看家基因平均Ct值 对照组目的基因平均Ct值 对照组看家基因平均Ct值 F= 2 - 公式： 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的相对定量方法之一 ??Ct ?Ct待测 ?Ct对照 F=2 -??Ct 相对定量——2