多聚酶链式反应PCR.ppt

PCR引物设计 一对引物，分别与靶DNA5’和3’端互补 长度：15～30个核苷酸 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性 引物的设计可以参照： 两分钟StepByStep学会引物设计软件 Primer premier5.0/oligo软件 核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版/ PCR技术讨论版 引物设计： 1.长度在15-30bp，GC含量在45-55%之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T)。 2. 碱基分布表现出随机性，避免相同碱基连续 排列。 3. 3’不能与引物内部互补，以免形成二级结构。 4. 两个引物各自的3’不能互补，以免形成自身 扩增。 5. 引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他 非目的DNA高度互补，才能使用。 PCR的反应特点 特异性强 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将pg=10- 12级的起始待测模板扩增到微克(?g= 10 -6)水平 简便、快速：PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应 对标本的纯度要求低： DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测 五、注意事项  ⑴　使用的全部溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染. ⑵　所有PCR试剂中使用的水都应