酵母朊蛋白sup35nm体外淀粉样纤维形成与解聚的动力学及其细胞毒性研究-病原生物学专业论文.docx

山 东大学博士学位论文，，含有个结合位点是蛋白的功能区尽管端的位氨基酸足以保。，，证 体外淀粉样纤维的形成但是由于该肤段在外界环境中的可溶性极低导致。难以捕捉纤维形 成的动 态过程因此一般选用段研究体外淀粉样纤维。的形 成。，如今， “淀粉样纤维的自我增殖代表了阮病毒的遗传方式”这一观点已得，到了广泛的认可然而却仍存在许多问题有待于解决例如淀粉样纤维形成，过程中的一个重 要特征是 非 纤维状寡聚体的出现然而这些寡聚体的动力 学作。用却仍不清楚淀粉样纤维的生长是通 过纤维末端寡聚体的聚集还是单体添加，。，的方式进行的越来越多 的证据表明蛋白寡聚体形式可能是导致淀粉样病变，，的毒性物质然而对成熟纤维是否具有毒性尚存在争议此外过 去的研究多，集中在淀粉样纤维的形成过程对其解聚过程的关注甚少而对解聚过程的研，，，究将有助于我们理解纤维的形 成与生长机制并且对改进阮病毒的灭活方法也。具有重要的意义鉴此我们选用酵母阮蛋白为模型研究了体外，淀粉样纤维形成与解聚的动力学并在此基础 上进一步研 究了不同构象聚集产。物的细胞毒性作用、一酵母阮蛋白体外淀粉样纤维形成的动力学，为研究酵母阮蛋白在近似于生理环境的体外 条件下形成淀粉样，纤维的动态过程我们在中表达了蛋白 的段并用一，，、，如鳌合层 析对重组蛋白在尿素变性条件下进行纯 化超滤浓缩后稀释到缓冲液中调节蛋白浓度至娜几娜几及林比、在不同的时间点分别取出适量的蛋白溶液进行透 射电子显微镜观 察圆二色谱，检测以及蛋白酶消化试 验检测淀粉样纤维的形成同时利用硫黄素，、一，结合试验电泳和对其形成动。态进行监测为验证淀粉样 纤维自我增殖的特性将已形成的即淀粉，样纤维进行超声处理后加入 到新鲜的蛋白溶液中用结合试验检测 蛋白。聚集过程、同时表达，纯化融合蛋白以检测端融合的。，蛋白是否会影响的聚集特 性，结果显示蛋白在中以可溶的形式表达在变性条件下山东大学博士学位论文。成功 纯化出重组蛋白利用透射电子显微镜观察到了蛋，白在缓冲液中发生聚集时的形态变化包括不同构象的寡聚体，一，及直径为一的成熟纤维圆二色谱检测显示该过程伴随蛋白结构由螺旋到折叠的转变而且聚集物具有较强的抗蛋白酶消化的特性以上。结果均符合 淀粉样纤维的独特性质结合试验提示淀粉样纤维的形成在经。一。过了一个快速的生长阶段后达 到平台期电泳和，。，更直观地表明纤维形成过程中蛋白单体逐渐减少同时多聚体则逐渐增加而，且已形成的纤维会像 “ 成核单位” 那样加速新鲜蛋白的聚集此外研究发，，一。现纯化的融合蛋白在体外 也可以自发聚集形成纤维而且聚集物具有典型的折叠的结构特征，以上结果说明蛋白在体外近似于生理环境的条件下非常容 易，聚集 形成淀粉样纤维即使端融合表达的蛋白也没能改变易于 聚。集的特 性对体外聚集动态过程的研究及诱导转化试验又进一步为。阮病毒增殖的 “ 成核聚集模型” 假说提供了证据、二及其突变体淀粉样纤维加热解聚与再聚合的动 力学，，以往对阮病毒灭活的研究中发现℃加热可能会改变的结构使。之更容易被 蛋白酶所降解因此本文对淀粉样纤维的加热处理过，，程进行了详细研究以阐明加热 处理是否会引起多聚体结构的解聚或是蛋白折。叠状态的变化为此我们制备了及其个突变体突变体的构建，原 则 是 将印阮病毒结构域在保证氨基酸组成不变的前提下将其排列顺，、序随机打乱的成熟淀粉样纤维在沸水浴中加热不同的时间后或自沸水浴，，，、，取出于室温下放置的过程中取 样进行透射电子 显微镜观察结合试验以一。及队分析结果显 示在加热过程中纤维逐渐变短减少而 与。此同时出现一种颗粒状的结构并逐渐增多将样品加热后放置于室温，。。，下后发现其中的颗粒状结构又消失了并出现了再生的纤维结构这表明，球形颗粒是由纤维加热解聚产生的并具有重新聚合形成纤维的能力因此无论是从形态还是聚集特性上来讲它 与蛋白聚集过程中出现的寡聚体都非常山东大学博士学位论文，。，相似可能正是跟纤维形成密切相关的 “ 成核单位”这一结果从反面证实纤，，维的生长可以通过寡聚体的聚合产生而这应该是一个可 逆的过程加热条件。下的解聚 正是逆向反应的表现当然这些结果并不否定可能存在自纤维末端。添加单体的生长 方式、，利用结合试验对野生型及其突变体淀粉样纤维形成解 聚，以及解聚后再生的动态过程进行对比分析发现相对于个突变体而言野生，型的蛋白更容 易聚集形成淀粉样纤维而且所形成的纤维结构也最，。，稳定说明野生型的蛋白更适合以淀粉样纤维的结构而存在此外，沸水浴加热可以导致淀粉样纤维 结构的部分降解的结论为阮病毒。灭活方法的改进提供了帮助、三蛋白淀粉样纤维及其中间体对哺乳动物细胞的毒性，为研究酵母来源的蛋白淀粉样纤维及其中间体是否同哺乳动 物，细胞来源的淀粉样变蛋白一样对哺乳动物 细胞具有毒性并由此探 讨外来