常温下发芽七天绿豆芽不同部位的过氧化物酶的活性比较.docVIP

常温下发芽七天的绿豆苗不同部位过氧化物酶的研究 广州大学生命科学学院 510006 摘要:从绿豆芽的下胚轴和胚芽中分别提取出过氧化物酶.比较了绿豆芽的胚芽和下胚轴的过氧化物酶活性.并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,对胚芽与下胚轴的过氧化物同工酶进行了初步研究.两者果様化物酶同工酶的数量和活性有显著差异,绿豆芽胚芽有2条酶带,分别为Rf0.23和Rf0.49，绿豆芽下胚轴只有1条Rf0.23的谱带,并且胚芽过氧化物酶活性比下胚轴过氧化物酶高. 关键词: 过氧化物酶 电泳 同工酶 活力测定 1 引言 过氧化物酶(Peroxidase,POD,供体:H2O2,氧化还原酶,EC 1、11、1、7)是一类广泛存在于各种植物,动物和微生物体内的氧化还原酶,催化过氧化氢和有机过氧化物对各种有机物和无机物的氧化作用.其分子量范围为35000~100000，以及正铁血红素Ⅸ为辅基糖蛋白.可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用M KH2PO4 3mL,分别进行研磨. ③将研磨好的匀浆液进行离心4500rpm 15min ④离心过后,上清液即为POD提取液.将提取液定容到10ml,取5ml于零下20℃保存,作为电泳的POD样品样品 0 1 2 3 4 5 0.1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0.15mol/L NaCl/ml 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 每管中蛋白质浓度μg/ml 0 20 40 60 80 100 考马斯亮蓝G250溶液/ml 5 以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在电脑上绘制标准曲线. ②样品样品样品 0 1 待测液/ml 0 0.1 0.15 mol/L NaCl/ml 1 0.9 考马斯亮蓝试剂/ml 5 摇匀,1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色 2.3.3 愈创木酚氧化比色法测定过氧化物酶活性 过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中.在有过氧化氢存在的情况下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质.生成物质的浓度与含量成正比,使用分光光度计可测量出生成物的含量. 根据王琳[4]等的方法,稍加改进 ①备好酶液,将分光光度计调到波长为470nm. ②取2只光径为1cm的比色杯,愈一只中加入反应混合液2.0ml, KH2PO4 0.5ml,调零点. ③样品A470/min·mg蛋白质（或鲜重g）表示. 酶活性(△A470/min·mg蛋白质)=每分钟OD变化值 / 蛋白(mg)或鲜重 2.3.4 植物过氧化物同工酶电泳 同工酶是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式,即催化同一种反应而结构不同的一族酶.它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式,利用凝胶电泳技术可以将它们分开,用专一的作用底物和特殊染料,把需要分析的酶染色,在胶柱上呈现出同工酶谱.同工酶的不同分子形式,可以出现在同一生物的不同发育时期,选取不同部位的材料,酶带的情况就不一样. ①使用已提取好的下胚轴酶粗提取液与胚芽酶粗提取液,混入等体积的50%的蔗糖溶液,冰浴保存. ②安装电泳槽 使用封口胶封底和两侧,每侧用2个长尾夹夹住,防止漏胶. ③配制聚丙烯酰胺凝胶系统 (1)A液:1mol/LHCL48.0ml,Tris36.6克,TEMED2ml,加水至100ml, pH 8.9. (2)B液:丙烯酰胺56克；甲叉双丙烯酰胺1.47克加水至200毫升。 (3)C液:过硫酸铵（用前配制）2.8％，配100ml。 ④配胶 A:B:C:水＝2.5 ml: 5ml: 1ml:11.5 ml,每块胶需胶液20ml。配胶后将胶液做好的夹层玻璃板倾斜30°,并立即将胶液缓缓灌入夹层中，随后将玻板平放,再插入样品梳至梳齿3/4高度,等待20-30min凝胶凝固后,去胶带,清洗碎胶,轻轻拨出梳子. ⑤安装 将制的胶安装到电泳槽,凹面朝内,再用四个夹子固定,将缓冲液（需稀释10倍）加入到电极上下槽. ⑥将酶样品分别与含溴酚蓝的50%蔗糖溶液混匀,比例为1:1。 ⑦加样和电泳 样品（1）：下胚轴酶粗蔗糖混合液20微升； 样品（2）：下胚轴酶粗蔗糖混合液20微升； 样品（3）：下胚轴酶粗蔗糖混合液20微升； 样品（4）：胚芽酶粗蔗糖混合液20微升； 样品（5）：胚芽酶粗蔗糖混合液20微升； 样品（6）：胚芽酶粗蔗糖混合液20微升； 上、下电泳槽加电极缓冲液后在恒压200V（每板电流约10mA）进行电泳，当溴酚蓝迁至离凝胶下 端0.5—1厘米时停上电泳。电泳时间1.5—2小时。 用长针头注射器注水法自凝胶板上取出凝胶，凝胶要完整，不能断裂。 ⑧染色 将完整的凝胶置于大号培养皿中,加入染色液,浸泡整块凝胶,室温下染色1