细胞生长需要营养环境.docVIP

细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂（如琼脂）或固体培养物（如麸皮、大米等）便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。细胞培养泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一。[1] 设施器材 设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材： 一、玻璃器材培养皿、滴流瓶、刻读吸管、离心管、培养瓶、烧杯、量筒、三角烧瓶二、塑料器材 多孔培养板、培养皿、培养瓶 三、橡皮器材 橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器和针头 培养基 几种常用细胞培养基产品 BME（basal medium eagle）基础伊格培养基 MEM ⒊ DMEM ⒋ IMDM ⒌ RPMI-1640 ⒍ M199 ⒎ Mccoys 5A ⒏ F10\ F12 \DMEM混合F12（三）几种常用细胞培养配套试剂的配置（缓冲液、平衡盐溶液等） 1、无钙、镁、离子溶液（1000ml) 氯化钠（NaCl)8g磷酸二氢钠、（NaH2PO4H20）0.05g、氯化钾（KCl)0.2g、碳酸氢钠（NaHCO3）1g、柠檬酸三钠(Na3C6H5O7,H20）1g、葡萄糖1g、加去离子水或双蒸水至1000mL 2、PBS（Phosphate-Buffered saline）磷酸盐缓冲液 甲液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钠（无水）28.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL 乙液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钠（无水）2.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL 甲、乙液于4保存，使用时按表3-2所示比例，配制成所需pH浓度，高压灭菌后室温保存。 3、Hanks液（HBSSHank‘s Balanced salt solution) 母液甲（20x）配法 NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O（A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶于800mL双蒸水中，前一物质溶后再加后一种。 CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中，溶时不断搅拌（此液应单配，单溶）。 待上述两溶液中的“溶质”全溶后，将它们混合，再用双蒸水补至1000mL，向其中加2mL氯仿作为防腐剂，置4保存。 母液乙（20×）配法 Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖（A.R)20.0g溶于800ml双蒸水中。 0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01N、NaOH11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，过滤，pH为7.4，4保存。 待上述各“溶质”完全溶解后，用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂，置40保存。 3）使用液（1×）配法 取母液甲和母液乙各一份，加双蒸水18份，分装后，塞好瓶塞，挂上标志。以115高压灭菌25分钟（以免葡萄糖破坏），置室温后4保存，可使用几个月。临用前，用7.5%NaHCO3调至所需pH。 4、Eagles液（EBSSEagles Balanced salt solution) 是一种在二氧化碳（CO2）环境中短期维持细胞活性的平衡盐溶液，可用于细胞解离前的清洗、细胞或组织的运输、细胞计数时稀释、溶液的配置等。 5、HEPES液 生物缓冲液，化学性质稳定，在PH7.2~7.6范围内，比NaHCO3缓冲液的缓冲能力更强。 6、NaHCO3缓冲液 常规缓冲体系的一部分，但是不稳定，易受空气中CO2的含量而改变PH值，影响缓冲效果。具体步骤 一、复苏[1] 1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。 2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培