植物组织与细胞培养指导.DOC

实验一 实验室的组成、主要设备的使用方法及常用药剂的配制 目的 了解植物组织培养实验室的基本组成，掌握主要设备的使用方法及常用药剂的配制。 二、实验室的组成：参观本院的植物细胞与基因工程实验室。 三、主要设备的使用方法（课堂现场操作） 纯水仪、高压灭菌锅、分析天平、微波炉、酸度计、超净工作台、摇床、生物显微镜、体视解剖镜等。 四、几种常用药剂的配制 （一）、用95%酒精配比不同浓度酒精的配制。 学习配制70%和75%酒精。 （二）、消毒剂 1、20%次氯酸钠溶液　　称取20g次氯酸钠用适量的去离子水（或蒸馏水）溶解，然后用去离子水（或蒸馏水）定容至100ml。 2、0.1%升汞（HgCl2）溶液　　称取0.1g HgCl2用适量的去离子水（或蒸馏水）溶解，然后用去离子水（或蒸馏水）定容至100ml。 、洗涤剂 1、2HCl酒精　　95%酒精100ml加入2mlHCl 2、硫酸－重铬酸钾洗液 称取10g重铬酸钾加入蒸馏水90ml，加热溶解冷却后，逐渐加入浓硫酸175ml，放入棕色玻璃瓶备用，（注意：切记不可将盛过洒精，甲醛等原剂的药品玻璃器皿直接泡入洗液在，因为重铬酸钾是一种强的氧化剂，一旦被还原氧化，洗液变绿，失去洗涤作用）。这些器皿必须用自来水冲洗干净并晾干再浸入洗液。 、1摩尔浓度NaOH 和1摩尔浓度HCl配制。 摩尔浓度是指用1升（1000ml）溶液中所含溶质的分子量数来表示的溶液的浓度。用M表示。 1、NaOH摩尔浓度（M） NaOH摩尔质量=分子克数=40g 1M NaOH是指1000ml溶液中含有40克摩尔质量的NaOH，现要配制100ml，即需NaOH 4g。称取NaOH 4g，用少量去离子水（或蒸馏水）溶解，定容100ml. 2、HCl的摩尔浓度 具体配制酸的mol浓度时，应考虑原浓酸的比重mol浓度。 　　要求配制的mol浓度×需配制的体积×原酸分子量 V＝——————————————————————— 　　原酸的百分浓度×原酸的比重×1000 配制1.0M HCl 100ml，即量取38%，比重为1.19的HCl8.06ml加去离子水蒸馏水，定容至100ml。 思考题 怎样构建商品性生产的组培室？ 实验二 洗涤与灭菌 植物组织培养能否成功重要的一环是在无菌条件下进行操作与培养，导致污染的来源主要有：⑴器皿和用具；⑵培养基；⑶培养材料；⑷工作人员本身；⑸　操作时的环境。防止污染的有效方法是将所有与培养有关的器皿，用具、培养基、接种室、培养室等进行灭菌和无菌操作。 一、洗涤 （一）、玻璃器皿的洗涤 1、新购置的玻璃器皿的洗涤 因有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水浸泡、洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。 2、已用过玻璃器皿 先将残渣除去，用清水洗净，再用热肥皂水或洗衣粉浸泡、洗净，然后用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。 3、对一些不宜刷洗的玻璃器皿如：吸管，滴管及较脏的器皿等先用去污粉和去油剂刷洗，自来水冲干净后，晾干，再浸入硫酸－重铬酸钾洗液中浸泡若干小时，用夹子取出在自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1－3遍，稍晾不滴水后置于干燥箱内烘干备用。 4、对带有凡士林，石蜡，或胶布的器皿选用特殊方法处理后，再用常规方法洗涤。带有凡士林的器皿须先用废纸把凡士林擦去，再用汽油擦洗干净，然后用热肥皂水煮沸半小时，刷洗后，自来水冲干净。若带有石蜡，可在玻璃器皿下垫几层废纸，放入60－70℃烘箱中加热1－2小时，待石蜡融化后，再用废纸反复擦2－3次即去石蜡，再泡入有洗衣粉的热水中洗干净，最后用自来水冲洗。若有胶布粘着物，先用70%酒精棉球擦数遍，溶解粘胶物，并用少许去污粉刷抺，再用洗衣粉煮沸半小时，刷洗干净，自来水冲洗，晾干，备用。 (二)、金属器皿 新购置金属器皿因其上有润滑油或防绣油，用蘸有四氯化碳（CCl4　）布擦去油脂，再用湿布擦净，干燥备用。 二、灭菌 （一）器皿和用具常用灭菌方法： 1、热压灭菌法 将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，在1.1kg／cm2压力下灭菌20－30分钟。 2、干热灭菌法 　洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，150℃ 40分钟或120℃两小时，待冷却后使用。 （二）、接种室、培养室的灭菌 1、用新洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。 2、薰蒸 用甲醛、高锰酸钾提前1－3天薰蒸密封房间： 方法1：甲醛倒入蒸发皿加热，用量10ml/m2。 方法2：甲醛（HCHO）与高锰酸钾（KMn4）以10：1比例混合。 接种前用70－75%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。 用紫外光灯进行照射灭菌（波长2650－2660A最好）接种箱及用具20－30分钟。 　（三）、培养基灭菌（略） 　（四）、培养材料灭菌（略） （五）、工