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第四节 荧光定性和定量分析 一、荧光定性分析 1. 定性依据 物质吸收紫外光和发射荧光的波长与分子结构有关,根据荧光激发和发射光谱可作定性分析。 2.定性方法 比较法:与标准物的荧光发射和激发光谱比较; 标准加入法:向试样添加估计存在的组分,如该组分特征峰均增强,说明这种组分存在; 同步扫描荧光法: 使荧光光谱简化和窄化,使不同组分互相重叠的光谱分开,提高选择性。 二、荧光定量分析 1.荧光强度与浓度的关系 在溶液浓度较大时(εcl≥0.05),随浓度增大,荧光强度反而降低。其原因,一是内滤作用;二是荧光发生不均。 2.影响荧光强度的其他因素 (1)各种散射光的影响 溶剂的瑞利散射光、胶粒的丁铎尔散射光、容器壁的散射光。波长与激发光相同; 溶剂的拉曼光,主要是斯托克斯线,波长比激发光长,是影响荧光强度的主要因素。 常见溶剂在不同激发光波长下的拉曼光波长 激发光 溶剂拉曼光波长 波长 水 乙醇 环己烷 四氯化碳 氯仿 248 271 267 267 - - 313 350 344 344 320 346 365 416 405 408 375 410 405 469 459 458 418 461 436 511 500 499 450 502 消除溶剂拉曼光干扰的方法: 选择合适的溶剂。如北激发波长为405nm,荧光波长为470nm。用环己烷(拉曼光458nm)作溶剂干扰大,用CCl4(418nm)可避免干扰。 改变激发光波长,使拉曼峰向短波方向移动。如激发波长改为365nm,环己烷的拉曼光为408nm,对北的荧光(470nm)干扰减小。 测定纯溶剂的拉曼峰强度,即空白,然后进行校正; 选择使用合适的滤光片以消除拉曼光的干扰; 8-巯基喹啉在不同溶剂中的荧光波长和荧光效率 介电常数 荧光峰(nm) 荧光效率 乙腈 38.8 410 0.064 丙酮 21.5 405 0.055 氯仿 5.2 398 0.041 四氯化碳 2.24 390 0.002 ⑶ 温度的影响 随温度降低,荧光强度增加。如,荧光素钠在0℃以下,每降10℃ 荧光效率增加3%。-80 ℃时达到100%。 低温荧光测定技术,可大大提高灵敏度。 ⑸ 激发光照射 可能引起光敏物质的分解。 ⑹ 荧光熄灭 荧光物质与溶剂或其他溶质作用引起荧光强度下降的现象。卤素离子、重金属离子、氧分子和硝基化合物是常见的熄灭剂。 3.定量分析方法 标准系列法: 测定已知浓度的标准溶液,绘制荧光强度-浓度的工作曲线。 三、荧光分析法的优点 1.灵敏度高。可检测10-10~10-12g/ml, 2.有机物分析选择性高。受激发光波长和荧光波长两个条件的制约。 3.应用范围广。不发生荧光的物质可通过适当的反应生成强荧光物质,然后分析。 4.方法快速简便,重现性好。 5.可用作HPLC的检测器,或与薄层、纸层等联用。 应用实例 维生素B2的测定: 激发光波长:430~440nm; 发射光波长:535nm。 pH6~7时荧光强度最大,pH约11时荧光消失。 用荧光法测定血液中的甘油三酸酯(血脂) (1) 试样用KOH的异丙醇溶液水解得到甘油; (2) 高碘酸钠将甘油氧化为甲醛; (3) 甲醛和乙酰丙酮和氨反应生成3,5-二乙酰基-1,4-二氢卢剔啶。其荧光激发波长405nm,发射波长505nm。 线性范围:血清中甘油三酸酯浓度400~4000 ?g/mL HPLC 氨基酸分析 氨基酸分析 OPA 邻苯二甲醛 荧光试剂 反应式 分析特点 * 苯并(a)芘的荧光激发光谱和发射光谱 (实线为标准物,虚线为试样) 比较法定性 苯并(a)芘和苯并(k)荧蒽的荧光激发 和发射光谱比较 苯并(a)芘 苯并(k)荧蒽 利用同步扫描荧光光谱进行定性分析 蒽 北 某工厂区大气样品萃取物的荧光光谱和同步扫描谱 1. 芴; 2. 苊; 3. 2,3-苯并芴; 4.和5. 屈; 6. 蒽; 7. 苯并(a)芘; 8. 北; 9. 并四苯 当溶液浓度很稀(εc L ≤ 0.05)时, F
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