细胞工程精华 八、干细胞技术.pptVIP

* 本章内容到此结束 谢谢大家 欢迎研讨 * 【复习思考题】 名词解释：干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞 简述干细胞的分类及ESC和ASC的特点。 简述ES细胞建系的主要操作步骤。 * * * 胰腺干细胞和肝脏干细胞： 两者共同起源，可塑性关系密切； * * * 人肠道中由UACL细胞系组成的腺管着色 * * 皮肤干细胞 表皮 三种 持续性增殖 成分 相关腺体 毛囊——周期性增殖 * 骨骼肌干细胞：肌肉组织中存在卫星细胞，位于成熟多核肌纤维周围，基底层内，可分化为肌肉、脂肪、骨、软骨和间充质细胞。 心肌干细胞：过去认为，成体心肌细胞是终末分化细胞，但心脏存留内源性原始干细胞，也有人认为心脏移植时，骨髓细胞迁移所致。 * 血液血管干细胞（hemangioblast） 　　血液与血管发育密切相关，性腺中肾区含有内皮和造血细胞共同祖细胞称血液血管干细胞，具双潜能。 * 人工血管 人工软骨耳 * 组织干细胞形成的器官 * 第三节　干细胞技术的应用 * 干细胞的应用前景 探讨胚胎发育的调控机制 动物克隆及改良 细胞和基因治疗 建立药物筛选和研究平台 作为组织工程种子细胞来源 * * * 干细胞研究面临的问题 机制尚不清楚 临床治疗的安全性问题 技术有待突破 免疫排斥及伦理学和社会学问题 研究处于初始阶段 * 第四节　干细胞与组织工程 * 　　组织工程：是将细胞工程和材料科学相结合，利用具有较好生物相容性的材料，按缺损组织或器官的结构要求制成模型或支架放在体外培养系统中，使细胞沿着模型或支架不断地生长扩增，构建成新的组织、器官。 * 组织工程化皮肤 组织工程化骨骼 组织工程化血管 组织工程化管状器官 组织工程化腺体器官 * 一、种子细胞的进一步研究 ——自体细胞、异体细胞、胚胎干细胞 二、细胞培养技术的研究 三、支架材料的研究 生物相容性、可降解、强度、可塑性、降解与释放通路、自身再生能力 四、细胞与支架相互作用研究 * 五、植入试验与临床验证 六、检测及评介 七、产业化研究 八、展望 　　A、巨大的病人需求，目前，美，4000亿美元，伤残、老年人等； 　　B、政府重视：中国，一般，美、加、欧俄、澳重视； 　　C、企业介入：美，Amgen、Mectronic、Smith Nephew公司，我国企业介入晚 。 * * 合成聚合物加工的鼻状骨架 * 胶囊包裹系 * * 生物反应器正在搅拌由聚合物载体和细胞构成的生物人工人体部件(软骨) * 生物降解聚合物载体 * 细胞工程保肝新方法 * 新骨生长填补骨间空隙 * 新血管的形成 * 用于治疗的胶囊包裹细胞 * 3. ES细胞系的鉴定 形态学特征 核型分析 碱性磷酸酶（AKP）染色 SSEA-I 免疫荧光标记 分化能力检测 * 形态学特征 　　形态结构：胞体体积小，核大、有一个或几个核仁 　　生长特性：呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，彼此界限不清 * 核型分析 　　ESC具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验。 * 碱性磷酸酶（AKP）染色 　常用快绿（Fast Green Staining)染色法 　对照：以已建系的ESC（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，染色液中不含萘酚的为阴性对照 　结果：阳性结果为ESC染成棕色，阴性对照无色。小鼠3.5日龄胚胎ICM为强阳性。 * SSEA-I 免疫荧光标记 　　第1抗体，SSEA－1（鼠抗ES细胞单克隆抗体），1:100稀释；第2抗体，羊抗鼠 1：10稀释；封闭液，羊抗兔lgG。 　　步骤： 　　①杜氏PBS洗3次，2％Triton作用20 min； 　　②杜氏PBS洗3次，封闭液中静置20min； 　　③以杜氏PBS洗3次，加第1抗体于4℃过夜； 　　④杜氏PBS洗3次，加第2抗体于30℃温箱置30min； 　　⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。 　　样本在激光共聚焦图像系统下观察, 结果依细胞是否出现荧光作出判断。 * 分化能力检测 　体外分化试验→类胚体 　体内分化试验→畸胎瘤 　嵌合体形成→嵌合体 　核移植→重构胚 * ESC可进行诱导分化 用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导，90％以上的ESC分化为神经胶质细胞， 聚集培养的ESC诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。 将ESC注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。 用ESC作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。 * 4.ESC的建系与定向分化 ES细胞的分离： （影响因素——动物遗传背景，培养液及其添加物，