细胞生物学技术 知识课件2014细胞生物学新技术 知识(简).pptVIP

An electrophoretic mobility shift assay (EMSA), also referred as a gel shift assay, gel mobility shift assay, is a common technique used to study protein-DNA or protein-RNA interactions. This procedure can determine if a protein or mixture of proteins is capable of binding to a given DNA or RNA sequence, and can sometimes indicate if more than one protein molecule is involved in the binding complex. p65 NFκB binding sites 凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA） ，也称Gel Shift。检测转录因子与DNA结合的能力（in vitro) ： 检测转录因子与DNA结合的能力（in vitro) ： 凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA） ，也称Gel Shift。 TNFα - + - + NF-κB Free probe Vector His-Cax Cax不影响NFκB与DNA结合的能力（DNA binding capacity） 核蛋白粗提物 32P 标记NF-κB探针 1与2孵育, SDS,放射自显影 检测转录因子与DNA结合的能力（in vitro) ： 凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA） ，也称Gel Shift。 凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。 染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 该技术主要应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损失与凋亡分析。 下图是ChIP技术的作用原理。 = p65 Intact cell Crosslink with formaldehyde Harvest cells Sonicate to fragment chromatin Reverse crosslinking by heating at 65°C overnight and use RNAse and proteinase K to degrade protein and RNA Check fragmentation by running an agarose gel Divide chromatin into 3 aliquots: (1) input, (2) IP with IgG, (3) IP with p65 antibody Perform IP 活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物 将其随机切断 免疫学方法沉淀 Reverse crosslinking by heating at 65°C overnight Use RNAse and proteinase K to degrade protein and RNA Purify DNA and run PCR on target sequences (cyclin D) Run SDSto check if protein was precipitated by the antibody specifically input IgG p65 IgG p65 input IgG p65 Positive prime