细胞生物学技术 知识课件2015免疫细胞化学.pptVIP

免疫荧光技术将 荧光素作为标记物，使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位。 （一） 免疫荧光技术 荧光素： 能够产生荧光并能作为染料的一类化合物。在激发光的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光（发射光），在显微镜下可见，并随照射停止而消失。 荧光显微镜： 荧光显微镜的光源提供各种激发光，使受检标本内的荧光物质发出发射光. （应用荧光染料时都需要知道2个波长： excitation wave length, emission wave length) 如:１.异硫氰酸荧光素( FITC) ex:490nm, es:520-530 绿色 ２.四乙基罗达明 ex:570nm, es:595nm 明亮的橙色 ３.四甲基异硫氰酸罗达明 ex:550nm, es:620nm 橙红色 ４.藻红蛋白(PE) 多种，橙黄-红色 荧光素 海马细胞 微管蛋白 绿色(胞体、树突) 轴突终末蛋白 红色(突触) 共定位 黄色 A549细胞 人骨肉瘤细胞 牛肺动脉内皮细胞 红色：线粒体 绿色：溶酶体 蓝色：细胞核 红色：线粒体 绿色：内质网 紫色：细胞膜 红色：线粒体 绿色：高尔基 1.双重或多重标记，同时比较不同分子的位置及量的关系。 2.双重或多重标记，同时染色细胞器和感兴趣分子，可显示分子的亚细胞定位信息。 3.根据荧光素的强度，进行半定量分析。 免疫荧光技术优点： 是将酶作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位。 普通光学显微镜即可观察 （二） 免疫酶技术 酶 抗原 一抗 二抗 酶标二抗 酶—抗酶抗体复合物 抗酶抗体 酶标抗体法 抗酶抗体法 复合物法 酶标记的三种形式：信号的放大 一抗 二抗 抗酶抗体 一抗 二抗 抗酶抗体复合物 一抗 二抗 常用的标记酶： 辣根过氧化物酶 2.碱性磷酸酶 外源的酶，与细胞内的内源酶应该有明显区别. 两种方法： (1)过氧化物酶标记抗体 (2)过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法 （Peroxidase-Antiperoxidase,PAP） １.辣根过氧化物酶 （hoseradish peroxidase, HRP） 底物：DAB(二氨基联苯胺) 光镜下：棕黄色; DAB经锇酸固定后能生成锇黑,电镜下呈现高电子密度. HRP H2O2 H2O nDAB 锇酸 锇黑（高电子密度） DAB 氧化聚合物 (棕黄色) 显示辣根过氧化物酶（HRP） ２.碱性磷酸酶 （Alkaline phosphotase, AKP） 两种方法： (1)碱性磷酸酶标记抗体 (2)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（APAAP） （Alkaline phosphotase－Antialkaline phosphotase） b.底物：萘酚衍生物， 捕捉底物：固红或固蓝 产物：红或蓝色偶氮色素 AP BCIP 蓝紫色色素 NBT a.底物:吲哚酚酯BCIP，捕捉底物：四唑盐NBT， 产物：蓝紫色 显示碱性磷酸酶(AP) 1.反应后标本材料可长期保存。 2.观察定位信息时，可观察感兴趣分子在细胞整体 中的相对定位，颜色对比清晰。 3.同时观察阳性信号和阴性信号。 4.能用于电镜观察。 免疫酶技术优点： 亲和物质：具有多价能力的物质，与另一种亲和物质有高度亲和力，又能与抗体、蛋白质及各种标记物(荧光素、酶、胶体金等)结合