细胞生物学技术 知识课件2015原位杂交.pptVIP

光镜 非放射性原位杂交： 地高辛标记探针－碱性磷酸酶联结抗体检测 靶核酸 地高辛 标记探针 碱性磷酸酶 联结的抗地高辛抗体 抗体 标核酸的“标记物” 外加抗原 报告分子:AP 底物:NBT/BCIP 鼠肺纤维化模型： TGF-beta表达增多， 主要位于支气管上皮细胞 AP标记 VEGF在肝癌组织中的表达 AP标记 his-miR-21 蓝紫色信号 AP标记 靶核酸分子 地高辛标 记探针 小鼠抗地 高辛抗体 胶体金联结 的抗小鼠抗体 电镜非放射性原位杂交： 地高辛标记探针－间接胶体金检测 抗体 标核酸的“标记物” 外加抗原 报告分子:胶体金 Ⅰ型胶原蛋白 mRNA 电镜原位杂交 地高辛标记探针 胶体金联结抗地高辛抗体 用同位素标记探针来显示杂交反应的方法 （二）放射自显影方法（略） 方法： 切片上涂覆核子乳胶膜 ↓ 置于暗盒中于4℃干燥处自显影 ↓ 经显影和定影后在显微镜下观察银粒 在细胞和细胞器的分布情况 第二节 原位杂交方法 一、基本实验过程 二、一些关键问题 一、基本实验过程 探针标记→纯化→(变性) 　　　　　　　　　 ↓ 　　　　　　　　 原位杂交→杂交体探测： 　　　　　　　　　 ↑ 样品制备→切片→通透处理 放 射 自 显 影 免 疫 细 胞 化 学 组织样品准备（组织固定、脱水、包埋、切片） 通透（permeability) 预杂交 杂交 漂洗 封闭 抗体 显色 严格度 简要过程: 组织固定、包埋、切 ↓ 切片脱蜡、复水 ↓ 200mM盐酸,5分钟 （去除碱性蛋白提高杂交率） ↓ 0.4%Triton X-100,2分钟 ↓ 10μg/ml蛋白酶K,37℃,10分钟 ↓ 4%多聚甲醛,5分钟(灭活蛋白酶) ↓ PBS漂洗2×5分钟, 2×SSC漂洗2×3分钟,晾干 ↓ 例：地高辛标记cDNA探针用Anti-DIG-AP探测 通透处理 杂交液5×SSC液，加cDNA探针至2μg/ml, 沸水中变性5分钟后滴加于切片上 于湿盒中43℃杂交过夜 ↓ 37℃漂洗: 2×SSC、1×SSC各15分钟 　　　　 ↓ 0.5×SSC漂洗15分钟、PBS漂洗2×5分钟 　　　　 ↓ 　　　　BSA封闭30分钟（封闭杂蛋白） ↓ Anti-DIG-AP 1:1000稀释后滴加,孵育4小时 　　　　 ↓ AP底物NBT/BCIP稀释后滴加,避光孵育显色 　　　　 ↓ 显微镜下监控,见蓝紫色沉淀出现即终止显色 　　　　↓ 双蒸水冲洗,必要时用核固红衬染,甘油明胶封片 杂交：低严格度 漂洗：高严格度 第二节 原位杂交方法 一、基本实验过程 二、一些关键问题 （四） 杂交湿盒 （一） 防止靶mRNA分子降解 （二） 样品固定 （三） 通透处理 （五） 非特异反应 （一）去除或抑制RNA酶，防止靶RNA分子降解 原位杂交的靶分子是细胞中的 DNA 和 RNA DNA -- 是稳定的核酸，可以经受各种环境 因素作用而长久稳定不变 RNA -- 非常容易降解 （细胞内源性的RNA酶：很丰富，广泛 存在于环境中，耐热、耐酸碱，活力