细胞生物学技术 知识课件2015细胞生物学新技术 知识(简).ppt

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GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上, 充当一种“诱饵蛋白”。当目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白以及体外翻译等方法获得。 His-Cax - + - + HA-p65 - - + + IP: Anti-His IB: Anti-HA Anti-His Anti-HA IP: Anti-HA IB: Anti-His Total cell lysates 1 2 3 4 In Vivo Binding Assay (Co-mmunoprecipitation, CoIP ) (免疫共沉淀) protein A-agarose beads HA-p65 Anti-His-IgG Protein A His-Cax agarose beads 有时侯,抗体可以直接偶联到agarose beads上 Anti-HA-IgG His-Cax HA-p65 agarose beads M N O 现在我们有足够的证据表明,p65是Cax的相互作用蛋白 p65是转录因子NF –κB的一个亚基,NF –κB已经得到广泛深入的研究。 下一步的研究应该是Cax是否参与调节NF –κB的活性,如何调节? NF-κB的激活 转录因子(transcription factor) 在GPCR途径中有CREB 酶偶联受体: RTK-Ras-MAPK途径中有cMyc, cJun, cFos 其他:STAT、Smad 在受调蛋白水解依赖的信号转导途径中有NF-κB 在核受体信号途径中, 核受体自身为转录因子。 转录因子就是基因调控蛋白,通过与DNA上基因调控序列结合,调节基因转录。 在研究某些因素对NF–κB信号系统的影响的时候,分为不同层次: 细胞质层次: IκB激酶的激活(kinase assay) IκB的降解(Western blot) 细胞核层次: NF–κB与DNA的结合能力(in vitro) (EMSA) NF–κB与DNA的结合(in vivo)(ChIP) NF–κB与co-activator或co-repressor 的关系 0 5 10 15 30 60 0 5 10 15 30 60 min Vector His-Cax IκBα(37KD) β-actin Cax对IκB降解的影响(Western blot) 制备稳定表达Cax的细胞系: 逆转录病毒载体或pcDNA3 G418筛选 TNFα 抗原等蛋白样品经SDS处理后全部带上负电荷,从而使蛋白之间仅有分子大小的差异。 将少量待测蛋白样本加入夹在两块玻璃平板之间的聚丙烯酰酰凝胶顶部的加样孔中。 组织或细胞的蛋白裂解产物 凝胶 玻璃平板 将凝胶置于电场中,凝胶的底部接正极。 带负电荷的蛋白向凝胶底部的正极泳动,并按分子大小的不同形成分离的条带。 设置对照 阴性对照 (no DNA) checks reagents for contamination 阳性对照 checks that reagents and primers work especially importance if trying to show absence of expression of a gene 750bp Marker brain(+) brain(?) (?) 两种标记技术 染料染色 SYBR Green 探针标记 TaqMan 探针定量原理 SYBR Green染料 染料法的优缺点 成本低 广谱性 适合初筛 无模板特异性 灵敏度低 条件优化   研究实例(数据有所调整) 药物A可增强某种肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感性,欲研究药物A的作用机制,对药物A处理前后的细胞进行cDNA array分析,发现药物A可诱导蛋白质Cax mRNA水平的增高。 以Northern Blot 检测 Cax在各种组织中的表达,包括一些肿瘤标本。   研究实例(数据有所调整) 以Northern Blot 检测 Cax在各种组织中的表达 Expression of CAX in Mouse Tissues By Northern

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