细胞生物学技术 知识课件GFP细胞转染实验讲义.pptVIP

一）细胞的传代和计数的实验步骤 实验内容 1．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。 2．关闭超净台紫外灯，打开风机和照明。在超净台中用吸去培养皿中原有的细胞培养液。 3．培养皿中加入1-2 mL高压灭菌过的PBS，以洗去培养液的残留（培养液中的血清会抑制胰酶的消化作用）。洗涤可进行1～2次。 4．吸去PBS，加入200μl 0.125％～0.25％的胰蛋白酶，盖上盖子，轻轻摇晃，使胰酶能均匀地作用于所有皿底的细胞。室温或37°C放置1～2分钟，倒置显微镜下观察，当观察到细胞收回突起变圆时可于超净台中立即加入800μl的含血清的新鲜培养基（可37℃预热），终止胰酶的作用，经反复吹打，制成细胞悬液。 5．细胞悬液制成后，即可进行传代。传代可按照1传2或者1传3等比例进行，也可在完成计数后，按一定的细胞量进行传代。细胞计数时，如果悬液的细胞浓度过大，需先按一定比例稀释后，再进行计数。通过细胞计数还可计算出细胞的活力。以稀释10倍为例，取10μl细胞悬液，加入到装有40μl PBS的Ependorf管中，再加入50μl 0.4% 台盼蓝溶液，混匀后吸出10μl加到计数板上进行一次计数，最终的细胞数要乘以10。另外，悬液也可收集到管中，离心后用PBS洗涤。 完成3次细胞计数，计算细胞总数、活细胞数、细胞活力。 将2.5?104个活细胞传35mm的培养皿。 Facilities for counting cells 细胞记数 细胞数/ml原液= （4大格细胞数之和/4）×104 ×稀释倍数 Quantitation of cell viability by trypan blue exclusion. Mix a small aliquot of cell suspension with an equal volume of 0.4% trypan blue solution. 实验结果和记录 一、每个实验组实验结果记录表格 实验组（2.1） 计数 1 2 3 细胞 总数 活细胞数 细胞活力 平均活力 二、绘制细胞存活曲线（略） GFP转染哺乳动物细胞实验和细胞的传代培养实验 实验课流程安排 1.分组：A1~AD16 2.移液枪的介绍和熟悉: 三种规格的移液枪（P1000, P200, P20）； 刻度的调节；Tip头的使用。 3. 实验内容简介 4.实验原理和应用的介绍【转染（转染方式的介绍；脂质体转染的原理；LTX脂质体的特点）；荧光蛋白、表达质粒及其应用】 5. 转染的实验步骤 6.实验的时间安排和注意事项（超净台操作） 7.荧光显微镜的使用及注意事项 8. 细胞传代操作 9.实验总结 GFP转染哺乳动物细胞实验 实验目的 理解细胞转染的原理， 掌握细胞转染的操作步骤 学习荧光显微镜的结构、操作及注意事项 学习超净台内操作及注意事项 back 材料 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程 pEGFP-N1载体带有荧光蛋白的空质粒（看作携有外源基因的质粒） HeLa Cells人宫颈癌细胞系是一种人工培养，具有无限增殖能力的细胞， 1951年诞生至今已经整整60年了。在医学界， HeLa细胞被广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。 操作步骤 1．细胞准备： 密度40%-90% 2．形成DNA-HilyMax转染复合物： 3ul 质粒，3ul脂质体，120ul培养液(混合后在室温下静置15-25分钟) 3．添加转染复合物至细胞培养皿中 4．培养：放置于37℃ ，CO2培养箱培养 5．检测：转染后24至72小时观察 要求:每小组不得超过5分钟(看好时间) 戴口罩、穿鞋套入内；操作前手用75%酒精消毒。 在超净台内进行 关于转染（transfection） 关于荧光蛋白 关于脂质体转染法 实验原理和应用的介绍 关于转染（transfection） Transfection is the process of deliberately introducing nucleic acids into cells. The term is used notably for non-viral methods in eukaryotic cells. Genetic material (such as supercoiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected. Transfection of animal cells typically involves ope