ELISA法检测血清中HBsAg结果不确定度分析.docVIP

ELISA法检测血清中HBsAg结果不确定度分析 　　目前ELISA法在临床检验中已被广泛应用,具有一定的代表性,而有关ELISA法检测结果的不确定度评定的应用报道很少。本文根据JJF1059―1999《测量不确定度评定与表示》[1],通过对典型例子不确定度的分析和量化,建立了ELISA法检测HBsAg结果不确定度的评定程序,通过对检测结果不确定度的评估,对检测结果进行完整地表达,避免或降低了出现假阴性结果的风险。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　试剂为乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法),上海科华生物技术有限公司产品。设备为Thermo MK3型酶标读数仪。依据GB15990―1995《乙型病毒性肝炎的诊断标准及处理原则》[2]进行检测。 　　1.2 方法 　　在板架上放好酶标板条,每孔加入50 μL待测血清或阴、阳性对照,设阴、阳性对照各2孔。每孔加入酶结合物50 μL,置37℃孵育30 min。洗板5次后,每孔加显色剂A液、B液各50μL,置37℃孵育15 min。每孔加入终止液50 μL后,用酶标仪读数,取主波长450 nm,参考波长630 nm读取各孔OD值。 　　 　　2 结果 　　 　　2.1 被测物数学模型 　　公式:ΔA=S-CO 　　式中:ΔA―结论判定;S―待测血清吸光度值(OD值);CO―临界值(cut-off)=NCx×2.1。NC―阴性对照OD值;NCx―阴性对照平均OD值;2.1为修正系数。 　　2.2 结果判定 　　当阴性对照OD均值0.05时以实际OD值计算。ΔA≥0者为HBsAg阳性,ΔA0.05时以实际OD值计算,见表2。 　　 　　3 讨论 　　 　　3.1 分析和量化不确定度分量 　　3.1.1 临界值 CO的不确定度就是阴性对照平均值(NCx)的不确定度,NCx的不确定度主要由2个分量组成,即:由系统效应引起的阴性对照OD值NC的不确定度和由重复性试验(只有当阴性对照OD值NC大于0.05时)中随机效应rep引起的不确定度。阴性对照NC代表的是阴性对照在某特定波长下的吸光度值,根据朗伯一比耳定律,吸光度值与吸光系数(a或ε)、液层厚度(b)和阴性样液浓度(C0)成正比,对于某一特定的显色反应来说,吸光系数是个常数。因此吸光度值的不确定度主要与液层厚度和阴性对照样液浓度有关。 　　3.1.1.1 液层厚度b 影响液层厚度的主要因素就是溶液的最终体积,即:显色液物A(V2 )、B(V3)各50μL(V2、V3)+50μL终止液(V4)。由于3次取用溶液使用的是同一规格的移液器,所以由此产生的不确定度也是相同的。而影响移液器的体积不确定度的主要因素是移液器的校准(C)和温度效应(T)。① 移液器的校准(C)产生的不确定度u(C):根据JJG646―2006《移液器检定规程》[3]的要求,使用的50μL移液器其准确度为±3% ,按矩形分布处理,校准引入的标准不确定度为: 　　u(C)=50×3%/3=0.87(μL) 　　② 温度效应(T)产生的不确定度u(T):容量器皿的校准在20℃下进行,假设实验室的温度在(20±4)℃之间波动,水的膨胀系数为2.1×10-4 /℃[4],按矩形分布50μL的移液器由温度效应引入的标准不确定度为: 　　u(T)=50×4×2.1×10-4 =0.04(μL) 　　由于校准和温度效应是相互独立的两个分量,因此,显色液A 50μL(V2)的标准合成不确定度u(V2)为[1]: 　　u(V2)=∑Ni=1u2i(y)=u2(C)+u2(T)=0.87(μL) 　　同理,显色液B 50μL(V3)的标准合成不确定度u(V3)为:u(V3)=0.87(μL)。 　　同理,终止液50μL(V4)的标准合成不确定度u(V4)为:u(V4)=0.87(μL)。 　　因为u(V2)、u(V3)和u(V4)为相互独立的3个分量,由此,液层厚度b的标准合成不确定度u(b)为: 　　u(b)=u2(V2)+u2(V3)+u2(V4)=1.51(μL) 　　3.1.1.2 阴性对照样液浓度C0 阴性对照样液浓度取决于阴性对照样液量(V1)的大小,因此取决于移液器的准确度。同样影响移液器的体积不确定度的主要因素是移液器的校准(C)和温度效应(T)。 　　u(V1)=u(V2)=0.87(μL) 　　因为影响阴性对照样液浓度的仅有阴性对照样液体积一个分量,所以阴性对照样液浓度C0的标准不确定度为: 　　u(C0)=u(V1)=0.87(μL) 　　3.1.1.3 合成阴性对照NC的不确定度 液层厚度b和阴性样液浓度C0是相互独立的两个分量,又是相乘的关系,有[1] 2=∑Ni=12