冠心病心绞痛血瘀证血浆双向电泳-质谱研究.docVIP

冠心病心绞痛血瘀证血浆双向电泳-质谱研究 　　摘要：目的：进行正常人和冠心病心绞痛血瘀证患者血浆的双向电泳图谱检测，寻找心绞痛血瘀证血浆差异蛋白，探索心绞痛血瘀证的蛋白质组学特点。方法：采用双向凝胶电泳和基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱对6例心绞痛痰瘀互阻证患者、9例心绞痛气虚血瘀证患者和12例正常人血浆进行比较蛋白质组学研究，寻找心绞痛血瘀证血浆差异蛋白。结果：初步发现了Fibrinogen β chain、Fibrinogen γ chain、α1-Antitrypsin、Haptoglobinβ chain在心绞痛痰瘀互阻证和气虚血瘀证患者中均高表达，ApoA-IV、ApoA-I在心绞痛痰瘀互阻证和气虚血瘀证患者中均中低表达。结论：初步发现Fibrinogen β chain、Fibrinogen γ chain、α1-Antitrypsin、Haptoglobinβ chain、ApoA-IV、ApoA-I在心绞痛血瘀证患者和正常人血浆中存在差异表达，但结果有待运用其他生物学的方法进行具体的验证并探索其机制。 　　关键词：冠心病心绞痛；血瘀证；血浆；双向凝胶电泳；蛋白质组学；生物标志物 　　中图分类号：R259.414 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0724-03 　　 　　冠心病已成为我国人民的首要死因。据统计，在冠心病住院患者中，60%首要表现是不稳定性心绞痛(Unstable Angina，UA)。UA已经成为心血管内科最常见的综合征之一，研究冠心病不稳定型心绞痛的防治成为临床亟需解决的一个重大课题。血瘀证是心绞痛中常见的中医证候表现。心绞痛的发病机制现仍然不完全清楚，尚无早期诊断的特异性标志物。近年来蛋白质组学技术的飞速发展，为研究心绞痛的发病机制和探索早期诊断的生物标记物提供了新的思路和技术平台。由于在心绞痛发生、发展过程中，有许多炎症细胞因子以及有关信号通路的小分子蛋白参与，这些蛋白质在心脏中的变化必然会通过相应的途径释放至血液，引起其在血液中的浓度变化，同时也会级联其他一些相关蛋白质发生相应变化，从理论上为心绞痛的血浆差异蛋白质组学研究提供了依据。本研究采用双向凝胶电泳(2-dimensional gel electrophoresis，2-DE)和基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry ，MALDI-TOF-MS）技术对心绞痛血瘀证患者和对照组人群血浆进行比较蛋白质组学研究，寻找心绞痛血瘀证发病过程中血浆差异表达蛋白，探索早期诊断的生物标志物，以期为预防和早期治疗心绞痛提供帮助。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1临床资料6例心绞痛痰瘀互阻证、9例心绞痛气虚血瘀证住院患者，男7例，女8例，平均年龄（69±14）岁，均符合美国心脏病学院(ACC)/美国心脏学会(AHA)/美国医师学院及美国内科学会ACP-ASIM联合议定的“慢性稳定型心绞痛诊疗指南(1999年)”以及中华医学会心血管病学分会2000年制订的“不稳定性心绞痛诊断和治疗建议”标准。气虚血瘀证的诊断采用2002年国家食品与药品监督管理局《中药新药临床研究指导原则》制定的标准，痰瘀互阻证为兼有心血瘀阻证和痰阻心脉证者。同时排除以下患者：急性心肌梗死、心肌炎、心脏神经官能症、肋间神经痛；其他疾病引起的心绞痛，如风湿热、梅毒、先天性冠脉畸形、肥厚型心肌病、主动脉瓣狭窄或关闭不全者；合并有脑中风、糖尿病、肺部感染、肾炎、肾衰、泌尿系感染、风湿病、肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重疾病及骨关节病者；妊娠期或哺乳期患者，过敏体质患者。12例正常人年龄、性别相匹配，无血瘀证表现，其余基本情况一致。 　　1.2样品采集15例病人均于入院2天内取清晨空腹肘静脉血2mL，EDTA抗凝，经4℃，3000r/min，离心10min。取上清，分装，-80℃保存。正常人也于清晨取空腹肘静脉血，方法同上。 　　1.3材料pH4～7固相pH梯度干胶条（IPG）、IPG buffer（pH4～7）、3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）、二硫苏糖醇（DTT）、矿物油、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、考马斯亮蓝R350购自美国GE公司，过硫酸铵（AP）、琼脂糖（Agarose）、甘氨酸（Glycine）购自美国Amresco公司，其它试剂购自北京试剂公司。实验用水为Milli－Q去离子水。 　　1.4仪器Ettan IPGphorⅡ等电聚焦仪、Ettan DALT six双向垂直电泳仪、Multi TempⅢ温控循环水浴、E