登革病毒c基因rna二级结构及编码蛋白在病毒复制中的作用推荐.pdfVIP

中文摘要 中文摘要 员，包括4个血清型(登革病毒1．4型，DEN1—4)。登革病毒感染可导致登革热 (dengue shock hemorrhagicfever／dengue 11，000nt的单股正链RNA，包括57非编码区(untranslated region，UTR)、单一 7非编码区。其ORF编码3种结构蛋 frame，ORF)和3 开放读码框(openreading NS4B和NSS)。 黄病毒的衣壳(capsid，C)蛋白是病毒核衣壳的基本构成成分，多拷贝的C 蛋白将病毒RNA包裹形成核衣壳结构。黄病毒C蛋白具有4个a螺旋结构 (al—a4)，且该蛋白具有功能多样性。目前已经发现部分黄病毒的C蛋白对病毒 RNA复制及蛋白翻译具有调节作用，并且C蛋白对病毒复制的调节与其核定位 现象有关。登革病毒C蛋白的核定位现象提示我们，在登革病毒RNA复制过程 中，C蛋白也可能发挥了一定功能。除C蛋白本身外，C基因在病毒RNA复制 和翻译过程中也发挥了重要作用。黄病毒C基因紧邻与病毒复制密切相关的5 非编码区，而且在C基因中已经发现了多个在病毒复制和翻译过程中发挥重要 作用的RNA结构元件。位于C基因内的57环化序列(cyclizationsequence，CS) 和cliP元件对于病毒的复制和翻译均具有重要意义。但目前黄病毒C蛋白及C 基因中的结构元件调节病毒复制的机制还不十分清楚。在登革病毒中，尚无C 蛋白参与调节病毒复制的报道，而在C基因中是否存在其它影响病毒复制的 RNA结构元件的问题也没有明确的答案。 针对上述问题，本研究利用病毒复制子技术分析登革病毒C基因及其编码 蛋白突变对病毒RNA复制的影响，并通过与生物信息学手段相结合对C基因中 的保守RNA二级结构在病毒RNA复制过程中的作用进行分析；在发现C蛋白 核定位序列与病毒RNA复制有关的基础上，利用酵母双杂交技术筛选与C蛋白 存在相互作用的病毒及宿主蛋白，从而对C蛋白参与调节病毒复制的作用机制 进行探讨。研究内容主要包括以下三个部分。 中文摘要 一、 登革病毒c蛋白基因突变对病毒RNA复制的影响 为分析登革病毒C蛋白中是否存在影响病毒复制的结构，并分析其基因中 是否存在除5CS和cliP外其它影响病毒复制的结构元件，我们构建了含有不同 a螺旋编码序列缺失以及核定位序列突变的C基因的登革4型病毒复制子。然后 通过测定报告基因海肾萤光素酶的活性，分析不同突变对复制子复制水平的影 响。结果表明，对C蛋白核定位序列进行突变均不同程度的提高了复制子报告 基因的表达，提示登革病毒C蛋白核定位现象与病毒RNA复制有关，而此前并 没有关于登革病毒C蛋白核定位功能的报道；缺失c【1螺旋明显降低了复制子报 告基因的表达，而缺失u2一硝螺旋对报告基因的表达水平没有明显的影响。进一 步通过间接免疫荧光和实时定量RT-PCR在蛋白水平和核酸水平证实0【1螺旋的 缺失确实能够降低病毒RNA的复制效率，这表明C蛋白的a1螺旋或相应的编 蛋白对缺失0【1螺旋复制子复制的影响发现该复制子复制水平下降并非由于C蛋 白结构的改变所致，而可能与C基因中的RNA二级结构的改变有关。该结果为 进一步分析C基因及其编码蛋白在病毒RNA复制中的作用奠定了基础。 二、 登革病毒C基因RNA二级结构在病毒RNA复制中的作用 为分析缺失0【1螺旋的复制子复制水平下降是否由于C基因中的RNA二级 7非编码区和C基因前 结构元件被破坏所致，我们首先利用mfold软件对包括5 109位核苷酸在内的登革病毒基因组5 测。结果表明，登革4型病毒C基因的54．98位核苷酸序列形成了一个在登革 侧环及基部双链区四个部分组成，并且该结构覆盖了仅1螺旋编码区。为分析 因的突变体复制子，然后测定报告基因的表达水平，进而分析复制子复制和翻译 水平的变化。结果表明，不同突变复制子在转染后6h的报告基因表达没有明显 区别，说明calHP并不影响病毒的翻译过程。而对此二级结构的部分或全部序 列进行