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膜片钳技术资料整理专帖（二） 膜片钳之实验操作篇131、请问有没有哪位师兄师姐是做的培养的窦房结细胞的膜片钳实验？记录的那种离子通道？我是以为新人，而且不是学习电生理专业的，希望大家帮助！你如果要做窦房结细胞的好，请用兔子等大动物，大鼠的窦房结细胞细胞是很难分离的，记录的哪种离子电流那要看你实验需要了。132、我在分离豚鼠心室肌细胞形态很奇怪,细胞整个缩小,比平常要窄很多,满布颗粒和空泡,如果细胞能量受损,通常是水肿混浊啊,有没有什么情况会导致细胞受损,而整个细胞却缩小呢?很可能是你配的无钙液渗透压过高所致 ,仔细核对一下你加的各种溶质是否正确,特别一不 小心算成原来剂量的10倍,或者干脆重新配制溶液。 133、电阻上升是由于破膜不完全，或者电极内液有污染堵塞电极所至。解决方法：1） 适当增大电极的口径，以利于破膜；2 ）电极内液使用前一定用0.22目滤器过滤；3 ）灌注电极液的器具也要保持洁净；4 ）电极现用现拉；5 ）电极下降入细胞外液时给予一定的负压防止此过程中灰尘堵塞电极134、国内淋巴细胞L型钙通道的研究甚少，不知哪位兄弟姐妹做淋巴细胞钙通道的全细胞膜片钳技术，急性分离的活的人外周血淋巴细胞游走性大，如何固定，固定剂对细胞膜通道的功能有无影响，请兄弟姐妹们不吝赐教。国内就没有几家淋巴细胞膜片钳做得好的，有点难啊。要研究淋巴细胞L型钙通道啊? 淋巴细胞有L型钙通道表达吗? 表达多吗 (我没详细查过这方面资料)? 估计即使有表达也不多，全细胞电流估计不会超过50 pA。淋巴细胞的贴壁固定倒不难，培养皿用poly-L-lysine包被一下即可，多聚赖氨酸浓度不要太高，低于 10 microg/ml 即可，包被过夜，第二天吸干就可以用了。poly-L-lysine对细胞膜通道不会有影响。 谢谢了，国内少数人做过钙通道，L型该通道国外有很多报道，国内据我所知还没有人做。 135、我现在正进一步摸索分离细胞的条件，但是感觉很不稳定，而且有时分出来的细胞看着很漂亮，可是做膜片钳的时候一破膜电阻就掉到几十M，所以我觉得看似好的细胞实际也不一定好，这样一来就不知该怎么判断了，还请大家帮帮忙啊，有什么好的建议啊?多谢多谢！我主要做神经细胞patch，心肌细胞也试着做过几次，觉得比神经细胞容易啊。确实，细胞看着很漂亮，但不一定patch就好做。破膜后掉，关键还是细胞膜状态不好。细胞膜弹性好，patch就好做，你试着用电极压压细胞，看能否出现明显的“酒窝状”凹陷，若有，细胞状态应该还可以，此时破膜后掉，就可能是电极尖端开口直径不当，或负压、zap破膜有待改进。如果是细胞状态不好（多半是这个问题），可重点从两个方面考虑进行改进:1）. 酶消化程度：不可太过，能分散到足量细胞即可；2）. 吹打分散：尽量轻柔，次数不宜多，注意吹打的吸管前端开口大小应适当(2 mm)，且进行抛光。136、还有个问题就是分离的细胞药物干预不是看即时作用，该怎么做啊？我看到有的文献上将药物与细胞共孵育5-9个小时（比如ACEI类），这样可行吗？而且这样就不是同一细胞的前后对照了，可以吗？请各位前辈指点！顺便问一下：有没有用RT-PCR做心肌离子通道mRNA水平和用WESTERN－blot测通道蛋白水平的兄弟姐妹啊？有事请教！springcoming wrote：药物干预分离细胞一般是共孵育几个小时得，可是时间长短不好控制，因为分离得细胞在体外存活是有一定时间的，而且分离下来后要死亡一大部分。一般孵育时间不易过长。至于对照，一般是同一次分离的细胞分出对照组，给药组，或者其他的，这样应该没问题。我也想做RT-PCR心肌离子通道mRNA水平检测，提过mRNA，有降解现象，分离细胞不太好提，目前尚在摸索。 但是也有人说分离的细胞个体差异比较大，这样的对照不准确，不知道是不是这样？我想问一下师兄是不是做单细胞RT-PCR，为什么是提分离细胞呢？不能直接提取组织吗？提取mRNA用细胞和组织都可以的，培养的细胞要先消化下来再进行提取，分离的可以直接处理提取，这个和实验设计有关。我不是做单细胞的，是分离细胞的体外急性实验，一般也就几个小时。 137、请问各位战友，谁做ATP依赖的钾通道啊，能否传授一些经验，正在摸索，没有头绪啊，不胜感激我做心肌细胞KATP电流我一般先用开放及剂100uM pinacidil先使其开放，用特异性阻断剂10uM glibenclamide完全阻断，证实我所记录到的是KATP电流在100uM pinacidil先使其开放的基础上再给予所需研究的药物，观察该药物对KATP电流的影响我的外液配方是(mM) 140 NaCl , 5 KCl , 1 MgCl2 , 1 CaCl2, 10 Hep