微波帮助酶解技术在蛋白及多肽研究中的应用.pdfVIP

摘要 微波辅助酶解技术作为一种高效快速的蛋白酶解技术，具有作用时间短，酶 解速度快、酶解产物可控等特点，近年来被应用于蛋白组学分析及多肽分离与分 析中。微波辅助酶解技术主要包括自由酶酶解以及微波辅助周定化酶酶解等，自 由酶酶解由于酶活相对较高而成为主要研究手段。而固定化酶技术具有酶与产物 易分离的特点。本文采用微波辅助自由酶以及固定化酶技术，以广硒特色资源食 材银杏蛋白和野生黑蚂蚁蛋白为原料研究两种蛋白的快速与定向酶解，对微波辅 助自由酶酶解以及基于磁性材料I司定化酶酶解技术进行了研究并对实验条件进 行了优化，主要研究内容如下： (1)对微波辅助自由酶酶解蚂蚁蛋白进行了研究。几种蛋白酶的优化结果 表明木瓜蛋白酶对蚂蚁蛋白具有较好的酶解效果。在温度50℃、底物浓度0．02 rain、给酶量5500 W的微波作用 g／mL、酶解时问60 u／g的条件下，在功率为300 h的蛋白酶解率(50．83 下，蚂蚁蛋白酶解率能够达至1]62．40％，优于常规水浴酶解6 ％)。对酶解液的总抗氧化性以及DPPH自由基清除实验表明，酶解过程产生的多 肽混合液具有一定的活性。凝胶电泳法表明酶解产物的分子量分布主要在14．4 KDa以下。HPLC分析表明：在微波辅助作用下，木瓜蛋白酶可以较好地对蚂蚁 蛋白进行酶解，可产生丰富的多肽片段。 (2)研究了微波辅助下化学共沉淀合成Fe30·磁性粒予，并以Fe304磁性材 料为载体研究木瓜蛋白酶的固定化。对戊二醛的浓度、给酶量以及固定化时间等 同定化条件的优化研究表明，戊二醛浓度为3．75％、给酶量为0．4mg／mL、固定 化时间为4h时获得的固定化酶效果最佳，酶的固定化效率达52．03％。在微波辅 助的条件下对蚂蚁蛋白进行酶解(50℃，60 1．75％。对固定化酶 rain)，酶解率达3 和自由酶的酶解率、酶解液的抗氧化活性和DPPH自由基清除能力的对比实验表 明，固定化木瓜蛋白酶能够用于蚂蚁蛋白的酶解，SDS—PAGE和HPLC对酶解物 的对比分析表明，酶解液中多肽片段的差异导致了酶解液生物活性的差异。 (3)在微波作用下，分别采用菠萝蛋白酶和固定化菠萝蛋白酶(戊二醛浓 度0．625％，给酶量0．4 h)对银杏蛋白进行了酶解研究(底 mg／mL，固定化时间4 W)。蛋 物浓度0．Ol U／g，酶解时问30rain，微波功率300 g／mL，酶与底物i：1,4500 白酶解液的酶解率、DPPH自由基清除及HPLC对比实验表明，自由酶及固定化 菠萝蛋白酶结合微波辅助均可快速高效地用于实际蛋白酶解以及酶解产物多肽 的研究。 关键词：微波辅助酶解，固定化酶，银杏蛋白，蚂蚁蛋白 Abstract afastand efficient for dlgestion As high technologyprotein，microwave·assisted and of in andthe analysispeptides hasbeen proteomicsseparation widelyapplied of control ofitsshort