区分肌纤维类型异染ATPase法改良研究.docVIP

区分肌纤维类型异染ATPase法改良研究 　　摘要：目的：完善区分肌纤维类型的异染ATPase染色方法，为相关的实验研究提供借鉴和参考。结果发现：染色方案一可显示4种肌纤维类型：I、IIA、IIB和IIC。大鼠骨骼肌在预孵育液pH值4.35左右时，出现最佳染色结果；而蟾蜍骨骼肌在预孵育液pH值4.40～4.70都出现了较佳的染色结果。染色方案二只能区分3种肌纤维类型：I、IIA和IIB。出现较佳结果时，大鼠和蟾蜍预孵育液的pH值也不同。结论：异染腺苷三磷酸酶法区分骨骼肌纤维类型，染色方案一可区分四种肌纤维类型，而染色方案二可区分三种肌纤维类型；出现最佳染色结果时，大鼠和蟾蜍骨骼肌的染色条件稍有不同，存在种属差异。 　　关键词：肌纤维类型；骨骼肌；异染腺苷三磷酸酶（ATPase）法；甲苯胺蓝 　　中图分类号：G804.21文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)05-0610-03 　　 　　肌纤维类型有不同的分型标准，采用组织化学染色方法，根据肌纤维ATP酶染色方法，可以将肌纤维分为I型（慢肌）、II型（快肌），II型纤维又进一步分为A、B、C三种亚型。经典的方法是在1955年由Padykula and Herman［1］首次报道 ，把肌纤维区分为I型和II型，后来又经Guth and Samaha［2］（1969）和Brook and Kaiser［3］(1970)及别的学者改良，可以区分I、IIA和IIB型三种肌纤维，但需要连续切片，并且需要在不同pH值的溶液中分别孵育不同的次数，相邻切片之间对比才能区分出不同的肌纤维类型。1977年Tunell and Hart［4］报道在同一张切片上可以区分出3种肌纤维类型：I、IIA和IIB。1983年Doriguzzi C等［5］ 又有所改进，用阳离子染料甲苯胺蓝和天青A染色，I、IIA和IIB型分别为绿松石色（turquoise），浅紫罗兰色（light violet ），和深紫罗兰色（dark violet），用水性介质封片后，染料很快就会扩散，颜色褪去。用酒精脱水中性树胶封片后，颜色变为深浅不一的蓝色，出现了异染到正染的转移。以上学者的方案都没有很好的区分出IIC型纤维。1990年，Ogilvie and Feeback［6］用人骨骼肌标本首次描述了异染腺苷三磷酸酶法能够在一张切片上同时区分I、IIA、IIB和IIC4种肌纤维类型的方法，并且乙醇脱水中性树胶封片后异染的颜色不褪色，可以长期保持。该方案后来又经Konishi M 等［7］（2000年）改良。因课题需要区分大鼠骨骼肌的肌纤维类型，采用了Ogilvie and Feeback［6］的方法，但并未出现原文所描述的染色结果，又参考Konishi M等［7］的方法，将预孵育液的pH值重新调整后，终于出现了较佳的染色结果。鉴于以前的学者取材对象都是哺乳动物，为了证实种属差异的存在和寻找最佳的染色条件，在参照相关文献［6,7］的基础上，设计了如下实验。 　　 　　1材料和方法 　　 　　1.1取材和切片?10周龄SD大鼠、蟾蜍（购自北京大学医学部）。大鼠称重后，戊巴比妥钠腹腔麻醉（5 mg/100 g），迅速分离大鼠腓肠肌；破坏蟾蜍的脑组织和脊髓后迅速分离腓肠肌。分别小心剪取约3×3×5 mm的腓肠肌（切勿牵拉），O．C．T.（Lab-Tek Products，Naperville）包埋，投入用液氮预冷的装有异戊烷（-70℃）的小烧杯中骤冷后用锡纸包好放入液氮中保存，用时移入恒冷切片机（-20℃）内。切片厚度10 μm，自然晾干或吹风机冷风吹干备用。 　　1.2配制溶液?1）预孵育液：蒸馏水475 mL，醋酸钾2.45 g，CaCl2?2H2O1.30g，用冰醋酸调pH至实验设计要求后加蒸馏水至500 mL。 　　本研究设定的预孵育液的pH值如下， 　　大鼠腓肠肌标本：4.25，4.30，4.35，4.40，4.45，4.50，4.60，4.65。 　　蟾蜍腓肠肌标本：4.35，4.40，4.45，4.50，4.55，4.60，4.65，4.70。 　　2）Tris缓冲液①：蒸馏水950 mL，Trizma碱（Sigma）12.10 g，CaCl2?2H2O2.60 g。 　　Tris缓冲液②：蒸馏水950 mL，Tris12.10 g，CaCl2?2H2O2．60 g。 　　分别用1N的HCl调pH至7.80后，加蒸馏水至1 000 mL。 　　3）孵育液①：蒸馏水30 mL，氯化钾185 mg，ATP二钠盐（Sigma）76 mg，氯化钙溶液（0.18M）5 mL，Sigma221(1.5M，2-amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液3.35 mL。用