多重链接探针扩增技术的反应步骤与应用.docVIP

多重链接探针扩增技术的反应步骤与应用 多重链接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）最早是由荷兰的Schouten博士于2002年发明的，是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行检测和分析的新技术[1].该技术仅需20 ng/μL模板DNA或RNA,即可通过简单的探针杂交、连接及PCR扩增和电泳步骤，在同一反应管中对多达50个不同的靶基因进行检测和分析。该技术经过短短几年的发展，目前已经在遗传疾病、基因甲基化分析等多个领域中得到了广泛应用[2-3]. 　　 　　1MLPA的原理 　　 　　MLPA技术是将核酸的杂交检测和PCR链式扩增相结合，从而实现多对靶分子的高效特异性分析。其核心技术是设计与目的靶序列高度特异性的长探针和短探针，发生MLPA反应时，这两段探针首先分别与模板序列杂交，之后通过连接酶将两段探针进行连接。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。长探针和短探针发生连接后，生成一条两端分别含有上下游通用PCR引物的全长探针，并在通用引物的扩增之下，使模板成链式放大，最后生成的PCR扩增产物通过毛细管电泳分离，再经软件分析[1]. 　　 　　2MLPA反应步骤 　　 　　2.1 探针与靶序列杂交 　　 　　在MLPA反应中，一个目标序列需要设计一对探针，包括长探针和短探针，短探针由两段核苷酸组成，包括位于5端的PCR通用正向引物序列和位于3端的模板特异性序列；长探针由三段核苷酸组成，包括位于5端的模板特异性序列和3端的通用反向引物序列外，在两者之间还添加了大小不等的填充序列（指纹序列），填充序列不是必须的，主要是用于区分扩增产物的大小。MLPA反应时，首先将双链DNA在98变性裂解，裂解为单链DNA,温度降为60时长短探针分别与单链DNA过夜杂交[1-3]. 　　 　　2.2 探针的特异性连接 　　 　　调节温度降为54，加入连接酶。如果被检核酸中含有靶序列，则长短探针可均与模板序列互补良好，连接反应可以进行，长短探针可以连接为一条完整的核酸单链。若其中一条探针的序列与被检靶基因序列不完全互补，即使只有一个碱基不互补，也会使杂交不完全而使连接反应无法进行。这种连接是高度特异性的，保障了MLPA的高特异性优势[1-4]. 　　 　　2.3PCR扩增 　　 　　MLPA扩增的并不是被检样本核酸，而是上述连接生成的与靶序列结合的完整核酸探针，只要有一条完整的核酸单链生成了，PCR扩增反应即可进行，这保证了MLPA技术的高灵敏性。连接反应完成后，每一条完整的核酸单链5端都带有通用PCR正向引物，3端都带有通用PCR反向引物。由于事先给每种被检基因的长探针加入了特定大小的指纹序列，每对探针的扩增产物的长度都是唯一的，在通用引物的扩增下，这些大小不同的扩增片段被同时扩增了出来，一般相邻两产物的长度差可以在10 bp之间，这样可以同时检测的基因数可高达50种不同靶基因[1-4]. 　　 　　2.4 毛细管电泳分析 　　 　　PCR扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳分离分析，也可通过毛细管电泳等进行分离分析。但一般情况下由于多重扩增的不同片段之间相差较小，而且，扩增片段大小多集中于90~150之间效果较好，普通琼脂糖凝胶电泳无法分离，建议使用毛细管电泳，再用相关软件分析电泳结果[2,4]. 　　 　　3MLPA的优缺点 　　 　　MLPA作为一种新型检测技术，具有如下优点：1.灵敏度高，所需样本量小，最少仅需20 ngDNA即可完成检测，检测限可达3 000~6 000个靶分子；2.多重分析，可同时检测多达50检测靶基因；3.特异性强，检测精准度高，可以区分单个核苷酸不同，保证了检测的特异性；4.高通量，一个反应可以同时检测多种病原，有利于疫病的及时确诊；5.自动化程度高，在PCR结束之后直接可用毛细管电泳分析结果，操作易于标准化；6.一次检测可完成96个样品的检测[1-2]. 　　 　　MLPA技术尽管有诸多优点，但其毕竟是一种新技术，局限性特别是应用方面的局限性是难免的：1.目前普及程度不高，试剂比较昂贵；2.探针设计比较困难耗时，不过一旦前期设计完成，后期的高通量检测工作即容易进行；3.由于需核酸杂交，操作比较繁琐而且费时；4.应用受限制，目前更多的应用还是基因突变和甲基化检测，在其他领域进展缓慢。 　　 　　4MLPA的应用 　　 　　4.1 用于检测人类基因或基因片段的缺失或重复 　　 　　人类很多遗传性疾病都跟基因缺失或突变有关，因此MLPA多年来在基因遗传性