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一株产纤维素酶菌株筛选及酶学性质摘要：以羧甲基纤维素钠为惟一碳源，从土壤中筛选出一株产纤维素酶的菌株ＸＷ－１３，其摇瓶培养液的ＣＭＣ酶活力为１５．０５ μｇ／ｍＬ，滤纸酶活力为１５．１３ μｇ／ｍＬ。酶学性质试验表明，该酶的最适反应ｐＨ ７．０，在ｐＨ ５．０～９．０时有较好的稳定性，酶活力保持６０％以上。该酶的最适反应温度为４０ ℃，在温度为２０ ℃时基本稳定，保温２ ｈ仍有８０％以上的活力。在化合物浓度为０．２ ｍｇ／ｍＬ的条件下，ＮＨ４＋、Ｎａ＋、Ｆｅ２＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋和Ｌｉ＋对酶活力有增进作用，Ｈｇ＋和Ｃｕ２＋对酶活力有抑制作用。 关键词：产纤维素酶菌株；筛选；酶学性质 中图分类号：ＴＱ９２０．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）08－1566-03 纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，是植物通过光合作用储能的主要形式［１］。关于土壤中纤维素酶的研究为充分利用纤维素提供了一条广阔的途径［２］。目前关于纤维素酶的研究报道集中于真菌与细菌方面，真菌主要以木霉为主［３－６］。纤维素酶是一类可以水解β－１，４葡萄糖苷键，使纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一个酶系的总称［７］。该酶系是由葡聚糖内切酶（Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ，ＥＧ， ＥＣ３．２．１．４）、葡聚糖外切酶（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＣＢＨ，ＥＣ３．２．１．９１）、β－葡萄糖苷酶（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＢＧ， ＥＣ３．２．１．２１）３个组分组成的诱导复合酶系［８］。 目前，纤维素酶的应用日益广泛，而纤维素酶高产菌却相对较少，因此高产纤维素酶菌株的筛选是关键问题之一［９］。从土壤中筛选到一株产纤维素酶的菌株，并对该菌株进行了产酶条件和酶学性质的研究，以期为纤维素酶产生菌的开发利用打下基础。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１土壤样品与化学试剂土壤样品采自树木种植地；化学试剂购于国药集团，均为分析纯。 １．１．２培养基富集培养基：羧甲基纤维素钠４．０ ｇ，ＮＨ４Ｃｌ ５．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。分离培养基：羧甲基纤维素钠４．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ４．０ ｇ，ＫＣｌ ５．０ ｇ，ＮａＮＯ３ ３．０ ｇ， Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，琼脂１８．０ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，自然ｐＨ。种子培养基：羧甲基纤维素钠 ８．０ ｇ，酵母粉 ５．０ ｇ，蛋白胨３．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ５．０ ｇ，ＫＣｌ ５．０ ｇ，ＮａＮＯ３ ３．０ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，自然ｐＨ。发酵培养基：羧甲基纤维素钠 １５．０ ｇ，大豆蛋白胨 ８．０ ｇ，酵母粉 ４．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２５ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，自然ｐＨ。ＬＢ培养基：胰蛋白胨１０．０ ｇ，酵母膏 ５．０ ｇ，ＮａＣｌ ５．０ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０。ＬＡ培养基：ＬＢ培养基中加入１．８％的琼脂粉。 １．２方法 １．２．１纤维素酶产生菌的筛选与粗酶液的制备 取１００ μＬ土壤样品溶液置于富集培养基中，在３７ ℃培养２４ ｈ，将富集液用无菌水梯度稀释，涂布于琼脂分离培养基上，倒置于３７ ℃恒温培养箱中培养２４ ｈ，然后用刚果红染色法［８］染色５ ｍｉｎ，去离子水冲洗后放置５ ｍｉｎ，观察菌落周围有无透明圈，若有透明圈则初步证明该菌株具有产纤维素酶的能力，挑取透明圈较大的单菌落进行划线，进一步分离纯化。将初筛得到的菌株接入种子培养基培养１２ ｈ，以２％的接种量转接到发酵培养基中培养２４ ｈ，然后4 ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，收集发酵上清液为粗酶液。用ＤＮＳ法测定酶活力。 １．２．２纤维素酶活力的测定纤维素酶（ＣＭＣ酶，滤纸酶）活力测定均参照２００３年９月１３日发布的中华人民共和国轻工行业标准《纤维素酶制剂》进行［１０］。酶活力定义：在上述试验条件下，1 mＬ酶液水解底物产生相当1 μg葡萄糖的还原糖量为1个酶活力单位，以μg/mL表示。 １．２．３酶学性质的研究 １）最适反应ｐＨ。配制不同ｐＨ的浓度为０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的缓冲液，缓冲体系及其ｐＨ分别为：ＫＣｌ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ ２．０）；甘氨酸－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ ３．０）；柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液（ｐＨ ４．０～５．０）；磷酸缓冲液（ｐＨ 6.8～8．０）； 甘氨酸-ＮａＯＨ缓冲液（ｐＨ 9.0～10．０）；Ｎａ２ＨＰＯ４－Ｎ