提出了具有創新性的同時測定幾丁質合成酶幾丁質酶和β-n-乙酰葡糖.docVIP

类别： A 编号： C2007-7 黑龙江省自然科学基金项目 计 划 任 务 书 资助类别：面上项目 项目名称：昆虫几丁质代谢相关酶的基因克隆、 异源表达及功能鉴定 项目负责人：樊 东 承担单位：东北农业大学 邮政编码：150030 通讯地址：东北农业大学农学院 电 话：0451执行年限：2008-01-01 -- 2010-12-30 黑龙江省自然科学基金委员会 二○○七年制 说 明 一、计划任务书是执行、检查和验收省自然科学基金资助项目的依据，必须按表格要求填写，应严肃认真、实事求是、指标明确、项目齐全，外来语同时用原文和中文表述。 二、项目承担者要严格按计划任务书所定要求执行。在承担项目期间，每年十一月末前须向省基金办公室提交项目年度执行情况报告；项目完成后三个月内须向省基金办公室提交项目总结报告和验收材料，经省基金办公室审核后组织验收。项目承担单位应认真监督检查项目执行情况，对项目所提交的报告要认真审查、把关，签署意见。 三、项目执行过程中，如出现无法克服的困难，不能按要求完成任务或需修改计划有关内容的，需经所在单位同意及时向省基金办公室提出书面申请，经审核同意后方可执行。 四、资助基金要单独立帐，专款专用，合理安排。对擅自挪用资金、违犯财经纪律和制度的单位或个人，将严肃处理。对不按计划任务执行和不按要求提交总结报告的将停拨下年度经费、追回原拨经费。 五、省基金资助项目取得的成果和有关论著，均应在其封面注明“黑龙江省自然科学基金资助项目”字样。 六、计划任务书要妥善保管，提交总结验收申请报告时要同时提交本计划任务书。 一、简表 二、研究内容和解决的关键问题（分别填写） （要解决的主要技术难点和问题，课题研究的创新点和内容等） 研究内容: 内容（1）：选择粘虫、小地老虎、甘蓝夜蛾、八字地老虎等4种夜蛾科昆虫和亚洲玉米螟、二化螟、草地螟等3种螟蛾科昆虫为供试昆虫，田间采集成虫，室内饲养、繁育。在幼虫取食期、蜕皮期和预蛹期提取虫体总RNA： a）利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术分别克隆昆虫的几丁质合成酶、几丁质酶、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶以及激素调控蛋白基因的cDNA序列。 b）利用Clone、DNAman、ClustalW、NCBI上的Blast等生物信息学软件对克隆到的基因进行生物信息学分析并登录Genbank。 内容（2）：在幼虫取食期、蜕皮期、预蛹期、蛹期、成虫期、卵期等多个生长发育关键时期，提取虫体总RNA；提取上述昆虫取食期和生长蜕皮期虫体的中肠、脂肪体、马氏管、体壁、肌肉、唾腺的总RNA；同时制备不同昆虫、不同生长发育时期和不同组织的粗酶液： a）利用RT-PCR和Real-time RT-PCR技术检测虫体不同生长发育时期、不同组织几丁质合成酶、几丁质酶和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶在RNA水平的表达，重点考察同一生长发育时期、同一组织中三种酶的在RNA水平的表达差异，分别以β-actin和α-tubulin基因作为内参。 b）利用Western blot对几种酶在昆虫体内不同时期和不同组织的分布进行测定。 c）利用粗酶液，以carboxymethyl Remazol Brilliant violet chitin（CM-Chitin-RBV）为底物进行几丁质酶活性测定，比较不同发育阶段、不同组织中几丁质酶的活性。 d）利用粗酶液，以p-nitrophenyl-b-D-chitobioside（p-NPCh）为底物进行β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性测定，比较不同发育阶段、不同组织中β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的活性。 内容（3）：利用多个大肠杆菌、毕赤酵母表达系统分别表达克隆的几丁质酶和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，表达蛋白进一步纯化。 a）以CM-Chitin-RBV为底物分别对多种表达系统表达的同一种昆虫几丁质酶进行活性测定，比较酶活性，确定酶的最佳表达系统。 b）以p-nitrophenyl-b-D-chitobioside（p-NPCh）为底物4）：完成表达的昆虫几丁质降解酶对昆虫以及含几丁质的植物病原真菌的影响。 a）分别以表达的几丁质酶和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶分别和按一定比例混合后对取食期昆虫进行体壁下注射和口服处理，1，2，3，4小时后分别在显微镜下检测围食膜的完整程度，同时测定对昆虫生长发育的影响。 b）提取4或5龄昆虫取食期中肠的围食膜，以表达的几丁质酶和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶分别和按一定比例混合后对围食膜进行处理。 c）分别以表达的几丁质酶和β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶分别和按一定比例混合后对主要植物病原真菌进行抑菌实验测试。 内容（5）：影响昆虫几丁质代谢相关酶表达的激素和激素调控蛋白的研究。 a）向新蜕皮的5龄或6龄幼虫的血腔中注射10微