基因诊断和基因治疗-PPT.ppt

AFLP原理： 首先利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接，形成模板。为达到选择性扩增的目的，再在模板末端添加具有选择性核苷酸（1～3个）的不同引物，然后PCR扩增，结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。 PCR扩增产物即等位片段之间 差别只有几个bp。 5、等位基因特异的寡核苷酸（ASO） 方法： 1、合成两种探针：① 已知突变位点的核苷酸序列（M） ② 正常基因碱基序列（N） 2、杂交实验结果： M+ N- 受检者是突变基因的纯合子 M- N+ 受检者是不存在突变基因 M- N- 受检者的缺陷基因可能是一种新的突变类型 M+ N+ 受检者是突变基因的杂合子 原理： 已知基因突变部位和性质，合成基因特异的核苷酸探针（20bp），标记后与受检者DNA杂交诊断。（可与 PCR联用：PCR-ASO） 6、单链构象多态性（SSCP） 日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的 空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或 多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变， 空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺 凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构 象上有差异的分子分离开. PCR-SSCP PCR-SSCP基本过程 ①PCR扩增靶DNA ②将特异的PCR扩增产物变性后快速复性; ③将单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; ④通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变. 7、基因芯片 将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测根据杂交分子和未杂交分子信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。 基本原理： （生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片） 基因芯片技术： 目的：检测外源性基因的侵入 目标： 1、微生物 2、病毒 如： HIV（致艾滋病 AIDS） 3、寄生虫、 4、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻风分枝 杆菌） 5、实验室培养的病原体（克立氏体） 四、基因诊断的 临床应用: 1、在感染性疾病检测中应用 艾滋病与HIV病毒 艾滋病由HIV通过接触、血液、血制品及母婴传播感染所致。HIV特异地侵犯辅助性T细胞（CD4），引起人体细胞免疫严重缺陷，导致顽固的机会性感染，恶性肿瘤和神经系统损伤。 HIV 感染后，95%感染者5个月可检出抗体（也有3-4年仍不能检出抗体）。有必要进行PCR技术检测。 艾滋病与HIV病毒 检测技术：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析 引物的设计：应在保守区（基因：pol, env, gag, tat) 病毒特点： HIV病毒由两条单链RNA组成，9.7k / RNA， 主要基因结构和组成形成与其他逆转录病毒相同，但较 之复杂，故称复杂反转录病毒 HIV属反转录病毒－－－即单链RNA反转录成双链DNA， 进入宿主细胞染色体。 非典型性肺炎（SARS） 由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）引起，多种 途径传播，传染性强、高致死率的急性疾病。 诊断依靠： 流行病学、临床表现、放射诊断、 血清学（荧光免疫、ELISA） PCR作为一种灵敏的早期病原学诊断必不可少 （关键是引物的合成） 2、在遗传病检测中的应用 产前诊断 检测妊娠8－12周的绒毛DNA或羊水细胞 PCR诊断一系列遗传疾病 镰刀状细胞贫血的诊断 方法：－RFLP诊断 MstⅡ酶切识别序列：CCTNAGG 切割正常β链序列：CCTGAGG 不切割突变序列：CCTGTGG －ASO探针诊断 3、在肿瘤检测中的应用 原癌基因 生物正常细胞基因中编码关键性调控蛋白的 癌基因 抑癌基因 一类抑制细胞增殖的基因，其失活可引起细 胞转化。 两类基因协同调控，使细胞生长处于平衡状态。 癌基因激活变化及检测： 1、基因扩增：即染色体某区段基因拷贝数增加，或癌基