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更多医学精品尽在医学吧 /rayshiu 更多医学精品尽在医学吧 /rayshiu 免疫检测 爱博泰克 常用免疫检测方法 待测的样品 定位、定性及定量研究 IHC 组织(细胞) 定性、定位 ELISA 血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液（分泌型蛋白） 定性、定量 WB 蛋白质样品 定性、半定量、（间接定位：胞浆胞核胞膜蛋白分离出来分别做wb） IHC(免疫组化Immunohistochemistry) 是融合了免疫学原理(抗原抗体特异性结合)和组织学技术(组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等)，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织(细胞)内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。 ELISA(酶联免疫吸附试验Enzyme linked immunosorbent assay) 用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。 WB (蛋白质印迹Western Blot) 先进行SDS，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。 Western Blot 步骤 2 原理 3 1 其他 3 3 原理 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变（这个过程就是转膜）。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 Protein Protein Blocking Agent Blocking Agent Blocking Agent Membrane Primary Antibody Secondary Antibody/Enzyme (E) E E s s s s s s s s s Product P P P P P 步骤 样品处理 凝胶电泳 样品印迹 免疫检测 结果分析 样品制备 组织、细胞、裂解液、蛋白酶抑制剂、 Loading Buffer 一般比例：新鲜组织1:10~20裂解液，细胞107-1ml裂解液，制备高浓度样品可酌情减少裂解液 裂解液成分：ph7.2~7.5的tris-hcl缓冲体系，有效裂解成分多为去污剂NP-40, Triton X-100，去氧胆酸钠 蛋白酶抑制剂：PMSF,COCKTAIL Loading Buffer：甘油，sds，还原剂（DTT或2-巯基乙醇） 样品制备 上样缓冲液处理蛋白质样品 SDS： 阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂(巯基乙醇）一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 四甲基乙二胺（TEMED) 丙烯酰胺 N,N-亚甲基双丙烯酰胺 过硫酸铵（AP) 激活作用 聚丙烯酰胺 共聚合 提供自由基 分离胶 分离胶母液 10%AP TEMED 浓缩胶 浓缩胶母液 10%AP TEMED 灌制分离胶 加入异丙醇 灌制浓缩胶 上样与电泳 Staking gel Separating gel 样品印迹 转膜：要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上。 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，硝酸纤维素膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。 免疫检测 封闭 一抗、二抗孵育 二抗与底物反应显色 曝光 免疫检测 封闭： 为避免NC与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对NC上的潜在结合位点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉（脱脂奶粉+PBST) Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。 免疫检测 一抗、二抗孵育： 把NC膜放在培养皿中，加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1小时。 倒掉一抗溶液，用PBST漂洗膜4次，每