药物分析第十六章-3.pptVIP

第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 影响各组分的最终位置和分离程度的因素： ①电场强度； ②溶液pH； ③溶液的离子强度； ④电渗现象； ⑤支持物的种类； ⑥温度； ⑦带点颗粒的性质。 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 根据电泳的分离特点及工作方式，电泳可分为三大类： 1.自由界面电泳 2.区带电泳 在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳。 3.高效毛细管电泳 第十六章 生化药物分析 纸电泳法 醋酸纤维素薄膜电泳法 聚丙烯酰胺电泳法 SDS琼脂糖凝胶电泳法 第三节 常用定量分析法与应用 （二）常用电泳法的类型及其应用 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 纸电泳法 纸电泳法是用滤纸作为支持介质的一种电泳法。 仪器装置 《中国药典》（2010年版）二部附录Ⅴ F收载的水平式电泳室装置如下： A：电泳槽 B：可密封的玻璃（或相应材料）盖 C：有机玻璃（或相应材料）板 D：铂电极（直径0.5～0.8cm） E：滤纸 F：有机玻璃电泳槽架。 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 电泳缓冲液的选择 应根据供试品的理化特性、需要的电泳速度和分辨力，选择适宜的缓冲液、pH值和离子强度。 如《中国药典》（2010年版）二部附录Ⅴ F纸电泳法中采用的是枸橼酸盐缓冲液（pH3.0)：取枸橼酸（C6H8O7?H2O）39.04g与枸橼酸钠（C6H5Na3O7?2H2O）4.12g，加水4000ml，使溶解。 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 滤纸的裁剪 取色谱滤纸置1mol/L甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4，置60℃烘箱烘干，备用。 滤纸可按需要裁成与电泳槽相当的长方形或长条形，并在距底边5～8cm处划一起始线，每隔2.5～3cm做一点样记号。滤纸长度视电源输出最高电压及所需的电场强度而定，电压恒定时，所需场强越大，滤纸裁得越短。 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 点样方法 分干点法与湿点法： 干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿。干点法能浓缩供试品，适用于稀的供试品溶液。 湿点法是将滤纸全部浸入缓冲液中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液，每点10μl，共3点，并留2个空白位置。点样部分点的次数不宜过多，稀的供试品溶液应预先浓缩。湿点法优点是可保持供试品的天然状态，点样后立即接通电源以免扩散。 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 电泳及区带显示 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液，浸没铂电极，接通电泳仪稳压电源档，电压梯度调整为18～20V/cm，电泳约1小时45分钟，取出，立即吹干，不同的供试品采用不同的显色方法，如核苷酸类药物可直接在紫外光灯（254nm）下观察定位，而有些物质必须用显色剂显色。用铅笔划出紫色斑点的位置。 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加如0.01mol/L盐酸溶液5ml，摇匀，放置1小时，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各品种项下的规定测定吸光度，并计算含量。 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 醋酸纤维素薄膜电泳法 系用醋酸纤维素薄膜为支持物的一种电泳方法，已应用于血清蛋白、脂蛋白等的分离和定量测定。其优点如下： ①对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象。 ②快速省时。 ③灵敏度高，样品用量少。 ④应用广。 ⑤染色后可制成透明的干板，利于扫描定量和长期保存。 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 聚丙烯酰胺电泳法（PAGE） PAGE的分离效果与分子所带电荷及分子量大小有关，已广泛用于酶、蛋白、聚核苷酸、多肽的分析鉴定和少量制备。与其他电泳法比较具有如下优点： ①区带不易扩散，用样量极微，分辨率高，分离时间短，重复性好。 ②凝胶机械性能优良，对热稳定，无色透明，无杂质，不溶于缓冲液，在280nm波长处无紫外吸收，利于蛋白质电泳后的扫描检测。 ③电泳时无电渗和吸附作用，适于样品定量和精制。 第十六章 生化药物分析 第三节 常用定量分析法与应用 SDS原理：蛋白分子与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）结合成复合物后，其所带的负电荷远远超