总蛋白测定与线性范围试验PPT.ppt

血清总蛋白（TP）测定与线性范围试验 一、血清总蛋白（TP）测定二、与线性范围试验 实验目的： 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法 熟悉722分光光度计的使用 了解TP测定的临床意义 一、血清总蛋白（TP）测定 + Cu2+ OH- CO(NH2) 2 + CO(NH2) 2 1. 实验原理 缩合 紫红色化合物 双缩脲反应： H2N-OC-NH-CO-NH2 OH- 蛋白质分子中的肽键 + 铜离子 紫红色复合物 （-CO-NH-） Cu2+ 紫色复合物在540nm波长有特定的吸收峰，其颜色的深浅与蛋白质的浓度在一定范围内成正比。 此反应和2个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与Cu2+作用生成紫红色复合物的反应相似，故称双缩脲反应。 2.双缩脲法测定总蛋白的原理 4.实验方法 取 5支试管，按下表操作：： 另取5支试管，按下表操作： 混匀，37℃，水浴10min，540nm波长，以空白管调T 100%、A“0”，测定各管吸光度值A，记录。 5.实验结果 参考值： 60~82g/L 6.注意事项 样品中TP含量超过100.0g/L则用蒸馏水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。 黄疸、溶血标本对本法有干扰，故用标本空白管来消除。 取量要准确，操作要规范。 7.总蛋白测定的临床意义 血清总蛋白浓度增高见于： （1）蛋白质合成增加（如多发性骨髓瘤）； （2）血浆浓缩（如呕吐、腹泻、高烧）。 血清总蛋白浓度降低见于： （1）蛋白质合成障碍（如肝严重受损）； （2）蛋白质丢失增加（如严重烧伤、肾病综合征）； （3）营养不良或消耗增加（如低蛋白饮食、严重结核病、甲亢）； （4）血液稀释。 8.思考题 （1）氨基酸可以用双缩脲法测定吗？为什么？ （2）蛋白质的呈色反应除双缩脲法外，还有哪些测定方法？ 二、线性范围试验 1.实验目的： 通过线性范围的测定，选择线性段作为该测定方法的分析范围。 掌握线性范围试验的评价及意义。 熟悉线性范围试验的具体操作过程。 在比色分析中，在符合Lambert-Beer定律的条件下，有色溶液的吸光度A与被测物质浓度C 成正比。 以标准物质浓度C 为横坐标，吸光度A为纵坐标，可在普通方格纸上绘出一条直线，即剂量反应曲线或校正曲线。 2.实验原理： 在此情况下，待测物浓度与吸光度的比值为一常数，直线上任何一点的斜率tanθ都相等，即tanθ=A1/C1=A2/C2=A3/C3=……An/Cn=K此处K即为校正常数。 在实际工作中并不存在理想的反应曲线，当被测物浓度过高、仪器处于非理想状态时，都可导致对Lambert-Beer定律的偏离，出现正偏离和负偏离现象。 因此，新建立的分析方法，其线性范围尚未确定时，为较准确地测出该方法符合Lambert-Beer定律的浓度范围，我们需要进行线性范围的测定。 线性范围的确定 ——要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释、重测的机会。 3.实验材料 试剂：商品双缩脲试剂、TP标准液、质控血清液（用蒸馏水稀释，浓度为120g/L）。 C1*V1=C2*V2 器材：试管、加样枪、722分光光度计。 取试管32支，除空白管、标准管外，1~10号管各做3个平行管，一共有10个浓度。按表三加样： 4.实验方法 5.实验结果 所得数据如实填入表四： 6.注意事项 1.标本的加量必须十分准确，应用准确度很高的加样枪进行加样。 2.稀释时，应使标准管系列成为精确的浓度等差系列。 3.同一浓度应采用三管平行操作，初步判断测出的吸光度值，若相差超过0.100 ，应去掉其中的异常数值后再算平均值。 4.标准溶液和样品溶液的蛋白质浓度均应超过10mg/mL。