11 动物细胞培养与表达制备药用蛋白_PPT课件.pptVIP

第11章 动物细胞培养与表达制备药用蛋白;本章主要内容;§11-1 动物细胞培养概念与历史;§11-2 动物细胞培养的特点;体外生长的动物细胞一般具有贴附性、细胞接触 抑制性、密度抑制性的特点。;接触抑制性 (Contact inhibition) 是指由 于动物细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象 （图）。由于这个特性，正常细胞并 不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。;（3）游走型细胞;（4）多形型细胞;1、培养工具;2、培养条件;3、动物培养基;（1）天然培养基;血清的生物功能;4.对培养中的细胞起到某些保护作用：;（2）合成培养基;例如;（3）无血清培养基;无血清培养基;4、动物细胞培养常用溶液;（2）培养基pH调整液;（3）细胞消化液;（4）抗生素溶液;1、动物细胞体外培养的一般过程;图11-8 动物细胞培养过程生长曲线;2、动物细胞原代培养;2.1 组织块原代培养法;2.2 组织消化原代培养法;组织消化原代培养示意图;1.检查细胞形态及活力：倒置显微镜下观察培养瓶中原 代细胞，生长良好者轮廓不清晰，较透明；生长不良者 反而轮廓清晰，形态不规则，胞内有空泡、颗粒等。 四唑氮蓝法(MTT)法可以检测细胞活力：活细胞的线粒 体脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨 （Formazan)并沉淀在细胞中。 2.培养液pH及污染检查：含血清的新鲜培养液呈桃红色，;倒置显微镜：组成和普通显微镜 一样，只不过物镜与照明系统颠 倒，前者在载物台之下，后者在 载物台之上，用于观察培养的活 细胞，具有相差物镜。;3、动物细胞传代培养;传代培养方法;酶消化传代过程;动物细胞的传代培养;11-5 细胞株与保存;3 动物细胞株类型;（1）原代细胞;（2）二倍体传代细胞;（3）融合细胞;（5）转化细胞;转化方法;CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)：从中国;Vero细胞（Vero cell）:是1962年日本从非;BHK-21细胞（Baby hamster kidney cell）：是 1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样， 异倍体。常用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白(例 如重组凝血因子VIII)。;（1）先酶消化分散成单个细胞，用冷冻保护液（含10%血清的培养液+10%甘油或二甲基砜DMSO）冷却，同时将细胞稀释成2~5*106个/ml。 （2）分装： 1ml /安瓶 （3）冷冻机内冷冻至-25℃ （4）液氮罐长期冷冻保存。 （5）细胞复苏： 37℃水浴快速融化 ;1、悬滴培养;3 培养瓶培养法;4 培养板培养法;5 转管培养法;1 悬浮培养;2. 微载体培养;2.1 微载体特点;2.2 微载体分类;2.3 微载体培养细胞方法;;1.游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。;2.3 微载体培养细胞方法;球传球接种技术;机械搅拌式：浆叶改造 充气搅拌式：需要改造;细胞生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维中外表面。;中空纤维反应器;板框式：平行排列的中空纤维床;模拟细胞在体内生长的三维状态。;1、有毒物质或抑制因子产生;原因：营养成分耗尽、有毒产物积累;灌注培养;11-10 动物细胞表达制备药用蛋白;1. 动物转基因方法;DEAE-萄聚糖法 早期使用转基因法，效率低。 原理：带负电的DNA吸附在带正电荷的DEAE（二乙氨乙基）表面形成颗粒，通过胞饮作用进入胞内。;脂质体载体包埋法 将需转移的外源DNA或RNA 与脂质体混合，带负电的 DNA自动结合到带正电的 脂质体内形成DNA-阳离子 脂质体复合物。由于脂质 体具有磷脂双层结构，与 细胞膜类似，因此可以与 受体细胞膜融合，从而将 外源DNA转入宿主细胞。 效率高。;逆转录病毒法;2. 转染细胞与筛选;3 目标蛋白高效表达策略;4 动物细胞表达药用蛋白应用;例1：tPA;例2 红细胞生成素EPO;促红细胞生长素（EPO）属于基因兴奋剂，可 以增加人体内的红细胞数量，从而使肌肉获得更 好的氧供，增强运动员的耐力。;兴奋剂;生产EPO的CHO细胞工程;例3：上海交通大学医学遗传研究所：