报告基因荧光淬灭.pptVIP

用于荧光素酶报告基因技术的载体 pGL3-Enhancer Vector：用来验证功能启动子元件的存在及活性 Dual luciferase assay of SAD-A 5′-UTR activity 荧光淬灭实验 是指导致特定物质的荧光强度和寿命减少的所有现象 荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭。基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物，且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝灭。激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭 由于荧光的再吸收、荧光物质发生化学变化而观察不到荧光的现象一般不称为荧光猝灭 利用某种物质对某一种荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对该猝灭剂的荧光测定方法，即为荧光猝灭法 荧光猝灭法比直接荧光测定法更为灵敏，具有更高的选择性 肿瘤转移过程 应用举例： MMP-2荧光分析药物筛选原理图 加入底物Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2，在37?C温育过程中，MMP-2水解底物，释放出Mca发光基团和Dpa淬灭基团。此时可以检测到荧光，随着时间延长，两种基团浓度增加，基团之间相互碰撞机率增大，导致发光基团荧光逐渐被淬灭。 表1.4B M205C4对MMP-2活性抑制作用 浓度 荧光值 酶活性抑制率 （nmol/L） （ABUs/min） （%） 0.0 2.57?0.04 — 5.0 1.79?0.08 30.3 10.0 1.74?0.16 32.3 25.0 1.25?0.11 51.2 50.0 0.71?0.08 72.3 100.0 0.14?0.01 94.7 多肽对MMP-2酶活性抑制作用 多肽对MMP-2酶活性抑制作用 重组人MMP-2分别与不同浓度的多肽M204C4（图A）M205C4（图B）在37?C温育45min后，加入底物，立即在波长Ex/Em=328/393测定荧光，每min1次，共10次，计算最大反应速率，同时与对照进行比较，所得百分率即为相对酶活性。实验重复3次，所得数据以???SD表示。 多肽对MMP-2酶活性抑制作用 状态栏 谢谢！ 报告基因技术和荧光淬灭技术 2008年诺贝尔化学奖由三位科学家下村脩(Osamu Shimomura)、Martin Chalfie 和钱永健 (Roger Tsien)三人分享。 1962年，下村修和约翰森从维多利亚多管水母（Aequoreavictoria）中分离生物发光蛋白-水母素（aequorin）时，意外地得到了一个副产物。它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。 1974年，他们得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白（GFP）。GFP在水母中之所以能发光，是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。 直到1992年，道格拉斯?普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP，文章发表在《Gene》杂志上。但具有讽刺意味的是，基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义，不愿提供经费。普瑞舍一气之下，离开了科学界，将GFP的cDNA送给了几个实验室。 GFP的结构以及发光原理，要到1990年代通过X光衍射才得到证实：GFP的肽链构成一个桶状结构，在其中心由3个氨基酸携带的芳香集团构成了发光核心结构。 但克隆并在真核细胞表达很长时间没成功 随后哥伦比亚大学的 Martin Chalfie 就考虑只用它的编码区域来表达。他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，通过UV或蓝光激发，在大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破，文章发表在《Science》杂志上。证明从水母上分离出来的GFP基因可以在其它物种上表达，正确地折叠，发出荧光。这些研究成果为GFP在生物学研究上的使用，奠定了基础。  钱永健的贡献，是利用他在活体荧光研究方面的丰富经验，对GFP进行改造，他的实验室利用定点突变改造出来 EGFP，不仅提高了荧光强度，更重要的可以在普通的荧光显微镜下用现有的荧光滤镜观察到，而且光谱单一，不会和其它荧光染料的光谱发生干扰。接着他的实验室又陆续推出了不同颜色的 GFP，如蓝色(BFP)和黃色(YFP)的荧光蛋白。这为同时在同一个细胞或组织内标记多种蛋白或结构打下了基础 用途： 1、构建融合表达质粒 N端、C端 定位，形成融合蛋白，观察细胞内蛋白质分子动态变化(pEGFP-C1,pEGFP-N1,Clontech) 2、转基因研究， 筛选转化细胞，追踪外源基因 3、判断蛋白质分子的相互作用和距